Universität zu Köln

De La Cruz, Nydia Camille (2023). Cellular determinants of Herpes simplex virus 1 (HSV-1) invasion in human skin: Unravelling conditions that allow HSV-1 to reach its receptor and internalize. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Herpes simplex virus 1 (HSV-1), which is among the most prevalent of human pathogens, targets mucosa, skin or cornea. The overall aim of this thesis was to explore how HSV-1 is able to invade the highly-protected tissue structure of the human skin, access its cellular receptors on target skin cells for entry, and initiate infection in the epithelium. On the cellular level, the focus was on elucidating the impact of cellular entry mechanisms in successful infection. Previous studies have demonstrated that HSV-1 exploits dual modes of uptake—direct fusion at the plasma membrane and endocytic internalization—to gain entry in keratinocytes, however, attributing the contribution of either pathway is still open. Here, infection of human keratinocytes at low temperature (7°C) was used as a tool to selectively block energy-requiring endocytic processes while permitting plasma membrane fusion. Although the uptake of the endocytic markers was inhibited at low temperature, ultrastructural analyses revealed the presence of free capsids in the cytoplasm as well as enveloped virus particles in vesicles after infection at 7°C. In addition to virus particles undergoing direct fusion at the plasma membrane, characterization of virus-containing vesicles revealed the release of capsids from vesicles by fusion with vesicle membranes. These results strengthen the role of endocytic internalization in successful infection. At the tissue level, the emphasis was on elucidating how HSV-1 overcomes the highly protective barrier function of the human skin to engage a cellular receptor for entry. To gain insights on the early entry events during HSV-1 invasion, ex vivo infection studies using human skin explants were implemented. As expected, the barrier function of full-thickness skin prevented HSV-1 invasion from the apical skin surface. Once the epidermis was separated from the underlying dermis, HSV-1 efficiently infected basal keratinocytes and later gained access to the suprabasal layers. Viral replication inhibitor experiments as well as uptake of labelled latex beads (500 nm) demonstrated the role of virus-induced tissue damage in enabling HSV-1 access to all epidermal layers. In contrast, only single infected cells were detected in the most apical part of the papillary dermis demonstrating that the extracellular matrix acts as a barrier against HSV-1 invasion. Strikingly, while partly open skin lesions of wounded full-thickness skin allowed the enhanced uptake of latex beads, nearly no infected cells were identified at the sites of wounds. Intriguingly, when wounds reached through the dermis, HSV-1 infected epidermal keratinocytes via the damaged dermal layer. To further elucidate the impact of epidermal barrier function in restricting HSV-1 invasion, pathological skin conditions characterized by impaired epidermal barriers were explored. As ex vivo infection of lesional atopic dermatitis (AD) demonstrated viral penetration from the skin surface, Th2 cytokines interleukin (IL)-4 and IL-13 were employed to induce AD-like phenotypes in skin without pre-existing barrier defects. Indeed, infected cells in the epidermis of IL-stimulated skin were found indicating that Th2 cytokine-driven inflammatory responses induced modifications that facilitate HSV-1 invasion via the skin surface. Overcoming epidermal barriers must be accompanied by viral engagement of a cellular receptor to initiate infection in the skin. Thus, the distribution of nectin-1, the major receptor on keratinocytes was investigated. To dissect how barrier formation correlated with receptor accessibility, a human epidermal equivalent (HEE) based on primary human keratinocytes was adopted. In undifferentiated keratinocytes, nectin-1 is readily accessible at apical and basolateral surfaces correlating with a high susceptibility to HSV-1. In fully differentiated HEEs, nectin-1 is expressed at the lateral membranes of most epidermal layers although accessibility to the receptor is restricted by functional tight junctions (TJs) in the upper granular layer thus correlating with no infection. Intriguingly, while IL-4/IL-13 stimulation of HEEs resulted in redistributed nectin-1 and TJ components, the IL-induced modifications had very minor effects on facilitated HSV-1 invasion in fully differentiated epidermal equivalents in contrast to human skin explants where IL-stimulation allowed HSV-1 invasion. Moreover, redistributed TJ components in IL-4/IL-13-stimulated skin and AD skin, both of which promote HSV-1 invasion, support the role of TJ barrier defects in the facilitated access of HSV-1 to nectin-1.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Herpes simplex Virus 1 (HSV-1), das zu den häufigsten Humanpathogenen zählt, dringt über die Mukosa, Haut und Kornea in seinen Wirt ein. Das Ziel dieser Dissertation war zu verstehen, wie HSV-1 in die schützende Gewebestruktur der humanen Haut eindringen kann, um seine Rezeptoren auf den Zielzellen zu erreichen und die Infektion im Epithel zu initiieren. Auf zellulärer Ebene lag der Fokus auf dem Einfluss zellulärer Eintrittsmechanismen, die für eine produktive Infektion verantwortlich sind. Bisherige Studien zeigten, dass HSV-1 zwei Aufnahmemodi nutzt – die direkte Fusion mit der Plasmamembran und die endozytische Internalisierung –, um in Keratinozyten einzudringen. Welcher Aufnahmeweg zu einer produktiven Infektion beiträgt, blieb bisher offen. Hier wurden Infektionsstudien in menschlichen Keratinozyten bei niedriger Temperatur (7 °C) durchgeführt, um energieverbrauchende endozytotische Prozesse selektiv zu blockieren und gleichzeitig die Plasmamembranfusion zu ermöglichen. Obwohl die endozytotische Aufnahme von Markermolekülen bei niedrigen Temperaturen gehemmt wurde, zeigten Ultrastrukturanalysen nach der Infektion bei 7 °C sowohl freie Kapside im Zytoplasma als auch umhüllte Viruspartikel in Vesikeln. Neben der Fusion mit der Plasmamembran, ergab die Charakterisierung virushaltiger Vesikel, dass die Hülle der Viruspartikel auch mit Vesikelmembranen fusionieren konnte. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die endozytische Internalisierung eine Rolle bei einer erfolgreichen HSV-1-Infektion spielt. Auf der Ebene des Gewebes wurde untersucht, wie HSV-1 die schützende Barrierefunktion der menschlichen Haut überwinden kann, um seine zellulären Rezeptoren zu erreichen. Dazu wurden Ex-vivo-Infektionsstudien mit humanen Hautexplantaten durchgeführt, um Einblick in die frühen Infektionsereignisse zu gewinnen. Wie erwartet, verhinderte die Barrierefunktion intakter Haut die Invasion von HSV-1 über die apikale Hautoberfläche. Sobald die Epidermis von der darunter liegenden Dermis abgetrennt wurde, infizierte HSV-1 effizient basale Keratinozyten und erreichte auch suprabasale Schichten. Experimente mit viralen Replikationsinhibitoren sowie die Aufnahme markierter Latexkugeln (500 nm) verdeutlichen, dass virus-induzierte Gewebeschäden HSV-1 den Zugang zu allen Epidermisschichten ermöglichte. Im Gegensatz dazu wurden nach Infektion der Dermis nur einzelne infizierte Zellen in der apikalen papillären Dermis nachgewiesen, was zeigt, dass die extrazelluläre Matrix eine Barriere für die HSV-1-Invasion darstellt. Interessanterweise, wurden nach Verwundung der Hautproben Latexkugeln über die Hautläsionen aufgenommen, es waren jedoch kaum infizierte Zellen nachweisbar. Wenn allerdings die Verwundungen auch die Dermis verletzten, konnte HSV-1 die epidermalen Keratinozyten über die Hautläsionen der Dermis erreichen. Um die Bedeutung der epidermalen Barrierefunktion auf die HSV-1-Invasion näher zu charakterisieren, wurde ein pathologisches Hautmodell untersucht, das durch defekte epidermale Barrieren gekennzeichnet ist. So führte die ex-vivo-Infektion von läsionalen Hautproben atopischer Dermatitis (AD) Patienten zu einer viralen Penetration über die Hautoberfläche. Zur weiteren Charakterisierung wurden AD-ähnliche Phänotypen induziert, indem Hautproben ohne Barrieredefekte mit den Th2-Zytokinen Interleukin (IL)-4 und IL-13 behandelt wurden. Tatsächlich waren infizierte Zellen in der Epidermis von IL-stimulierter Haut nachweisbar, was darauf hindeutet, dass Th2-Zytokin-gesteuerte Entzündungsreaktionen Modifikationen induzierten, die eine HSV-1-Invasion über die Hautoberfläche ermöglichten. Die Überwindung epidermaler Barrieren bedeutet, dass das Virus seinen zellulären Rezeptor erreichen kann, um eine Infektion auszulösen. Um zu analysieren, wie die Bildung der Barrieren mit der Erreichbarkeit des Rezeptors korreliert, wurde die Lokalisierung des Hauptrezeptors auf Keratinozyten, Nektin-1, untersucht. Dazu wurde ein humanes epidermales Äquivalent etabliert, das auf primären Keratinozyten basierte. In undifferenzierten Keratinozyten lokalisierte Nektin-1 an apikalen und basolateralen Oberflächen, was mit einer hohen Infizierbarkeit korrelierte. In ausdifferenzierten epidermalen Äquivalenten wurde Nektin-1 an den lateralen Membranen in den meisten Epidermisschichten nachgewiesen. Funktionelle tight junctions (TJs) in der obersten granulären Schicht können allerdings den viralen Zugang zu Nektin-1 verhindern, so dass keine Infektion zustande kommt. Interessanterweise führte die IL-4/IL-13-Stimulation von ausdifferenzierten epidermalen Äquivalenten zwar zu einer Umverteilung von Nektin-1- und TJ-Komponenten, die IL-induzierten Modifikationen hatten jedoch nur eine sehr geringe Auswirkung auf eine erleichterte Infizierbarkeit durch HSV-1. Dieser Befund war im Gegensatz zu humanen Hautexplantaten, wo die IL-Stimulation eine HSV-1 Invasion ermöglichte. Die Umverteilung der TJ-Komponenten in IL-4/IL-13-stimulierter und atopischer Dermatitis Haut, die mit einer HSV-1-Invasion korrelierte, lässt allerdings die Schlussfolgerung zu, dass defekte TJ-Barrieren den erleichterten Zugang von HSV-1 zu Nektin-1 ermöglichen können. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code De La Cruz, Nydia Camille nydiadelac@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-711154
Date:	26 September 2023
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HSV-1 English nectin-1 English atopic dermatitis English human skin English viral entry English epidermal barriers English epidermal equivalents English human keratinocytes English tight junctions English
Date of oral exam:	6 March 2023
Referee:	Name Academic Title Knebel-Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/71115