Universität zu Köln

Salamon, Sarah ORCID: 0009-0005-7435-405X (2023). CaV1.3 gating modulation by S1475 phosphorylation and disease-associated CACNA1D missense mutations. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Calcium-influx through CaV1.3 voltage-gated calcium channels is indispensable for physiological functions including auditory transduction, hormone secretion, and cardiac and neuronal pacemaking. Accordingly, altered CaV1.3 function can lead to sinoatrial-node-dysfunction, deafness, primary hyperaldosteronism, and neurodevelopmental disorders. Unique electrophysiological properties of CaV1.3 and a complex modulation of its activity suggest that differential (dys-) regulation is crucial for the (patho-) physiological role of CaV1.3. Therefore, this thesis aimed at contributing to the detailed understanding of CaV1.3 gating modulation from a physiological and pathophysiological perspective with a human emphasis. Using single-channel and whole-cell patch-clamp recordings in transiently transfected HEK-293 cells, phosphorylation-state imitating mutations of S1475 were investigated with respect to their role in CaV1.3 modulation. Furthermore, disease-associated CaV1.3 missense mutations L271H, A749T and F747S were electrophysiologically characterized in detail. Each disease-associated mutation displayed gain-of-function characteristics, but with individual gating phenotypes, i.e. leftward-shifted activation (L271H), additional increase of open probability (A749T), or induction of a novel kind of gating cooperativity (F747S), respectively. Differential dysregulation suggests the need for differential modulation as a putative treatment option in mutation-associated disorders. S1475 turned out to be relevant for modulating gating of human CaV1.3. The phosphorylation-mimicking S1475D mutation led to decreased, the phosphorylation-resistant S1475A mutation to increased current density, both mainly due to altered open probability on single-channel level. Notably, it became apparent, that S1475 is crucially involved in CaMKII- and calmodulin-mediated modulation of CaV1.3. Calcium-currents in response to stimuli mimicking sinoatrial-node-like action potentials indicate a putative role of S1475 phosphorylation state for heart-rate regulation. Structural modeling suggests altered intramolecular interaction to be linked to functional changes of both, disease-associated mutations and S1475 phosphorylation state. The findings of this thesis thereby contribute to the understanding of CaV1.3 modulation by resolving underlying molecular mechanisms and by proposing indications for therapeutically targeting CaV1.3 channels. Herein, unravelling the complexity of CaV1.3 gating modulation in a cellular context imposes a challenge, but is a prerequisite to eventually harness this knowledge to specifically modulate the channel in CaV1.3-associated diseases.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Calcium-Einstrom durch spannungsgesteuerte CaV1.3 Calcium Kanäle initiiert unter anderem physiologische Funktionen wie Hormonsekretion, auditorische Transduktion, kardiale Schrittmacherpotentiale und moduliert neuronale Aktivität. Dementsprechend kann eine veränderte CaV1.3 Funktion zu Erkrankungen wie Taubheit, Bradykardie, primärem Hyperaldosteronismus sowie neuronalen Entwicklungsstörungen führen. Spezifische elektrophysiologische Eigenschaften des CaV1.3 Kanals und die komplexe Modulation dessen Aktivität lassen vermuten, dass eine differenzierte (Dys-)Regulation für die (patho-) physiologische Funktion des Kanals entscheidend ist. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen Beitrag zum detaillierten Verständnis der Modulation des humanen CaV1.3-Schaltverhaltens aus physiologischer und pathophysiologischer Sicht zu leisten. Mit Hilfe von Einzelkanal- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in transient transfizierten HEK-293 Zellen wurde die Rolle phosphorylierungs-imitierender S1475 Mutationen auf das CaV1.3-Schaltverhalten untersucht. Darüber hinaus wurden die krankheitsassoziierten CaV1.3-Missense-Mutationen L271H, A749T und F747S elektrophysiologisch detailliert charakterisiert. Alle drei krankheitsassoziierten Mutation erhöhten die Einzelkanal Aktivität („gain-of-function“), jedoch mit individuellem Phänotyp hinsichtlich des Schaltverhaltens, d. h. eine links-verschobene Aktivierung (L271H), zusätzlich eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit (A749T), bzw. Induktion einer neuartige Kanal-Kooperativität (F747S). Die unterschiedliche Dysregulation legt die Notwendigkeit einer differenzierten Modulation als mögliche Behandlungsoption bei mutationsassoziierten Störungen nahe. Hinsichtlich der Phosphorylierungsstelle S1475, stellte sich heraus, dass diese für die Modulation des humanen CaV1.3-Schaltverhaltens relevant ist. Die phosphorylierungs-imitierende S1475D Mutation führte zur einer Verringerung, die phosphorylierungs-resistente S1475A Mutation zu einer Erhöhung der Stromdichte, beides hauptsächlich aufgrund veränderter Offenwahrscheinlichkeit auf Einzelkanal-Ebene. Insbesondere wurde deutlich, dass S1475 entscheidend an der CaMKII- und Calmodulin-vermittelten Modulation des CaV1.3 beteiligt ist. Veränderter Calcium-Einstrom als Reaktion auf Stimuli, die Sinusknoten-Aktionspotentiale imitieren, deuten auf eine mögliche Rolle des S1475 Phosphorylierungsstatus in der Regulation der Herzfrequenz hin. Strukturelle Modellierung deutet darauf hin, dass veränderte intramolekulare Interaktionen mit funktionellen Veränderungen sowohl der krankheits-assoziierten Mutationen, als auch des S1475-Phosphorylierungszustands einhergehen. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen somit zum Verständnis der Modulation des CaV1.3-Schaltverhaltens bei, indem sie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen aufklären und Anhaltspunkte für zu entwickelnde therapeutische Einflussnahme auf den Kanal liefern. Die Komplexität dieser Modulation im zellulären Kontext zu entschlüsseln, stellt zwar eine Herausforderung dar, ist aber Voraussetzung, um dieses Wissen für die gezielte Kanal-Modulation in CaV1.3-assoziierten Krankheiten nutzen zu können. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Salamon, Sarah sarah.sala@live.de orcid.org/0009-0005-7435-405X UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-711752
Date:	2023
Language:	English
Faculty:	Faculty of Medicine
Divisions:	Faculty of Medicine > Pharmakologie
Subjects:	Natural sciences and mathematics Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language L-type voltage gated calcium channels English neurodevelopmental diseases English phosphorylation English calmodulin and CaMKII English patch-clamp English UNSPECIFIED English
Date of oral exam:	8 August 2023
Referee:	Name Academic Title Isbrandt, Dirk Prof. Dr. Korotkova, Tatiana Prof. Dr. Mangoni, Matteo Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/71175