Universität zu Köln

Hepp, Christof (2017). The molecular mechanism of outer membrane DNA transport in bacterial transformation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Competence for natural transformation is widespread among bacterial species. In the case of Gram-negative systems, a key step to transformation is the import of DNA across the outer membrane. Although the proteins essential for transformation have been identified, the mechanism of DNA uptake remains to be elucidated. In this work, we combine fluorescence microscopy, nanomanipulation by optical tweezers and molecular biological techniques. Employing these methods, we reveal the mechanistic role of the periplasmic DNA binding protein ComE in DNA uptake over the outer membrane and compare the uptake efficiency of double-stranded DNA (dsDNA) and single-stranded DNA (ssDNA). We have shown that the periplasmic DNA binding protein ComE forms complexes with imported DNA at the site of DNA uptake in Neisseria gonorrhoeae. These relatively stable complexes support the accumulation of ample amounts of DNA within the gonococcal periplasm in a gene-dosage dependent fashion. Further, we provided evidence that ComE powers DNA uptake over the outer membrane of Gram negative bacteria via a translocation ratchet mechanism. In this type of active transport, the diffusion of a biopolymer inside a membrane pore is rectified by the binding of chaperones inside the target compartment. Our evidence can be divided into three parts: 1. The force-velocity relationship of DNA uptake is in very good agreement with a theoretical description of a translocation ratchet mechanism. 2. The velocity of DNA uptake depends on the concentration of ComE. 3. The force-velocity relationship of type IV pilus retraction excludes it as a power source for DNA uptake. Finally, we characterized DNA uptake and transformation of dsDNA and ssDNA in N. gonorrhoeae. For successful DNA uptake as a prerequisite for transformation, DNA has to bind to the cell surface in a first step in order to be transported across the outer membrane in a second step. We found that a double-stranded DNA uptake sequence (DUS) is required for species-specific DNA recognition and binding in the first step. In contrast, the kinetics of DNA transport in the second step are comparable for dsDNA and ssDNA, which is consistent with a ComE-dependent translocation ratchet mechanism. Based on our findings, we propose a more precise mechanistic model for the DNA uptake process into the periplasm of Gram negative bacteria. Initially, a type IV competence pilus binds DNA at the surface of the cell and threads it into the periplasm by pilus retraction. In a second step, ComE binds to periplasmic DNA and powers transport via a translocation ratchet mechanism. While the secondary structure of DNA is important for initial, species-specific DNA binding, it is irrelevant for DNA transport. A second, stronger molecular motor transports the transforming DNA from the periplasm to the cytoplasm.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Der molekulare Mechanismus der DNA-Aufnahme über die äußere Membran während der bakteriellen Transformation German
Translated abstract:	Abstract Language Die Kompetenz für die natürliche Transformation ist in Bakterien weit verbreitet. In gramnegativen Systemen stellt der DNA-Import über die äußere Membran einen entscheidenden Schritt für die Transformation dar. Obwohl die für die Transformation notwendigen Proteine identifiziert sind, musste der Mechanismus der DNA-Aufnahme noch geklärt werden. In dieser Arbeit kombinieren wir Fluoreszenzmikroskopie, Nanomanipulation durch eine optische Pinzette und molekularbiologische Techniken. Mithilfe dieser Methoden klärten wir die mechanistische Rolle des periplasmatischen DNA-Bindeproteins ComE in der DNA-Aufnahme über die äußere Membran und vergleichen die Aufnahmeeffizienz doppelsträngiger und einzelsträngiger DNA (dsDNA und ssDNA). Wir zeigten, dass das periplasmatische DNA-Bindeprotein ComE in N. gonorrhoeae mit importierter DNA an der Stelle der DNA-Aufnahme Komplexe bildet. Diese recht stabilen Komplexe erlauben die Ansammlung beachtlicher DNA-Mengen im Periplasma der Gonokokken in Abhängigkeit von der ComE-Konzentration Außerdem wiesen wir nach, dass ComE die DNA-Aufnahme über die äußere Membran gramnegativer Bakterien durch einen Translokationsratschen-Mechanismus antreibt. Bei dieser Art des aktiven Transports wird die Diffusion eines Biopolymers innerhalb einer Membranpore durch die Bindung von Chaperonen im Zielkompartiment ausgerichtet. Unser Nachweis gliedert sich in drei Teile: 1. Die kraftabhängige DNA-Aufnahmegeschwindigkeit stimmt sehr gut mit der theoretischen Beschreibung einer Translokationsratsche überein. 2. Die DNA-Aufnahmegeschwindigkeit hängt von der ComE-Konzentration ab. 3. Die kraftabhängige Geschwindigkeit der Typ-IV-Pilusretraktion schließt selbige als einen Antrieb für die DNA-Aufnahme aus. Schließlich charakterisierten wir DNA-Aufnahme und Transformation von dsDNA und ssDNA in N. gonorrhoeae. Erfolgreiche DNA-Aufnahme ist eine Voraussetzung für die Transformation. Dafür muss DNA in einem ersten Schritt an die Zelle binden, um in einem zweiten Schritt über die Membran transportiert zu werden. Wir fanden heraus, dass eine doppelsträngige DNA-Aufnahmesequenz (DUS) für die spezifische DNA-Erkennung und Bindung notwendig ist. Demgegenüber ist die Kinetik des DNA-Transports im zweiten Schritt für dsDNA und ssDNA vergleichbar, was mit einem ComE-abhängigen Translokationsratschen-Mechanismus übereinstimmt. Aufgrund unserer Erkenntnisse schlagen wir ein genaueres mechanistisches Model für den DNA-Aufnahmemechanismus ins Periplasma gramnegativer Bakterien vor. Zuerst bindet ein Typ-IV-Kompetenzpilus DNA an der Zelloberfäche und fädelt sie durch Pilusretraktion ins Periplasma ein. In einem zweiten Schritt bindet dann ComE an die periplasmatische DNA und treibt den Transport durch einen Translokationsratschen-Mechanismus an. Ein zweiter, stärkerer Motor transportiert die transformierende DNA daraufhin ins Cytoplasma. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hepp, Christof christof-hepp@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-73743
Date:	25 January 2017
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Physics > Institute for Theoretical Physics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Physics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language biophysics, transformation, molecular motors, genetics English Biophysik, Transformation, molekulare Motoren, Genetik German
Date of oral exam:	19 January 2017
Referee:	Name Academic Title Maier, Berenike Prof. Dr. Bollenbach, Tobias Prof. Dr.
Related URLs:	Publication Publication Publication
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/7374