Exploring the Role of HCN1 Pathogenic Variants in Developmental and Epileptic Encephalopathies: Insights from HCN1G380D and HCN1M142I Mouse Models

Kasemir, Jacquelin ORCID: 0000-0001-9176-5241 (2024). Exploring the Role of HCN1 Pathogenic Variants in Developmental and Epileptic Encephalopathies: Insights from HCN1G380D and HCN1M142I Mouse Models. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Developmental and epileptic encephalopathies (DEEs) are a group of severe neurological disorders that start in early life. They are characterized by frequent, often treatment-resistant seizures, and cognitive impairments. These disorders are frequently caused by de novo mutations in genes encoding voltage-gated ion channels. Notably, de novo mutations in the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated non-selective cation channel 1 (HCN1), which influence neuronal excitability, synaptic transmission, and rhythmic activity in neurons, particularly in cortex and hippocampus, have been identified in DEE patients. Patients with the p.G391D variant in HCN1 suffer from neonatal-onset epileptic encephalopathy characterized by severe intellectual disabilities, microcephaly, a resistance to anti-seizure medications (ASMs), and early death. Moreover, patients with the p.M153I variant suffer from early-infantile epileptic encephalopathy, displaying milder intellectual disabilities, and ASMs resistance. Two knockin mouse lines, Hcn1G380D (GD) and Hcn1M142I (MI), were generated, each carrying a heterozygous mutation homologous to those found in human patients. As shown previously, both GD and MI mice exhibit spontaneous epileptic seizures and locomotor hyperactivity. The current study aimed to further investigate behavioral comorbidities, such as motor coordination deficits, impaired spatial working memory, and altered anxiety behavior, with GD mice exhibiting more severe impairments than MI mice. Administration of ASMs, like lamotrigine or phenytoin, which are sodium channel blockers, induced epileptic seizures in both mouse models – a phenomenon also reported in patients with a pathogenic HCN1 variant. Interictal electrocorticogram (ECoG) recordings revealed reduced low and high gamma oscillations during rapid eye movement (REM) sleep in GD mice. Additionally, hippocampal CA1 silicon probe depth recordings in awake head-fixed GD mice in the Mobile HomeCage (MHC) showed reduced high gamma oscillations in stratum pyramidale (SP) during immobility and decreased ripple oscillation frequencies. Together, these findings suggest an underlying interneuronopathy in GD animals. Since HCN1 channels are expressed in the soma and distal dendrites of pyramidal neurons, the G380D mutation leads to reduced HCN1 protein expression in the hippocampus, and in vitro studies have shown decreased action potential firing in these neurons. In vivo CA1 unit analysis confirmed this finding, demonstrating reduced firing rates of pyramidal neurons in SP. Furthermore, HCN1 is found in axon terminals of parvalbumin-positive (PV+) interneurons. Preliminary results indicated similar firing rates of these neurons in SP between GD and wild-type (WT) animals but suggested potential feed-forward inhibition deficits. To further investigate the role of HCN1 dysfunction in interneurons in GD mice, a new mouse line was generated in which the G380D mutation is flanked by loxP sites, allowing the conditional cre recombinase-mediated removal of the disease allele. By using Gad2-cre mice, the GD allele was deleted in all GABAergic neurons. These mice (GDGAD) still show locomotor hyperactivity and attenuated gamma-oscillations during REM sleep but do not exhibit spontaneous epileptic seizures. Together, these findings support our hypothesis and provide conclusive evidence for an interneuronopathy in GD mice.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Title	Language
Untersuchung der Rolle pathogener HCN1-Varianten bei Entwicklungs- und epileptischen Enzephalopathien: Erkenntnisse aus den HCN1G380D- und HCN1M142I-Mausmodellen	German

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Abstract

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Entwicklungs- und epileptische Enzephalopathien (DEE) sind eine Gruppe schwerer neurologischer Störungen, die im frühen Kindesalter beginnen. Sie sind durch häufige, wiederkehrende und oft therapieresistente epileptische Anfälle gekennzeichnet, wobei auch kognitive Beeinträchtigungen auftreten können. Diese Erkrankungen werden häufig durch de novo Mutationen in Genen verursacht, die spannungsgesteuerte Ionenkanäle kodieren. Insbesondere wurden bei einigen DEE-Patienten de novo Mutationen im hyperpolarisationsaktivierten, zyklisch-nukleotidgesteuerten unspezifischen Kationenkanal 1 (HCN1) festgestellt, die die neuronale Erregbarkeit, synaptische Übertragung und rhythmische Aktivität von Neuronen im Kortex und im Hippocampus beeinflussen. Patienten mit der p.G391D-Variante im HCN1-Gen leiden an einer neonatalen epileptischen Enzephalopathie, die durch schwere geistige Behinderungen, Mikrozephalie, einer Resistenz gegen antiepileptische Medikamente (ASMs) und einen frühen Tod gekennzeichnet sind. Darüber hinaus gibt es Patienten mit der p.M153I-Variante, welche an einer frühkindlichen epileptischen Enzephalopathie leiden, eine mildere geistige Behinderung haben und ASM-Resistenz zeigen. Um diese Krankheiten näher zu untersuchen, wurden zwei Knock-in Mauslinien – Hcn1G380D (GD) und Hcn1M142I (MI) – erzeugt, die jeweils eine heterozygote Mutation im Hcn1 Gen tragen, welche homolog zu den beim Menschen gefundenen Mutationen sind. Wie bereits gezeigt wurde, weisen sowohl GD- als auch MI-Mäuse spontane epileptische Anfälle und lokomotorische Hyperaktivität auf. Die aktuelle Studie zielt darauf ab, weitere Verhaltens-komorbiditäten wie motorische Koordinationsdefizite, Beeinträchtigungen des räumlichen Arbeitsgedächtnisses und verändertes Angstverhalten weiter zu untersuchen, wobei die Ergebnisse zeigten, dass GD-Mäuse schwerere Beeinträchtigungen aufwiesen als MI-Mäuse. Die Verabreichung von ASMs wie Lamotrigin oder Phenytoin, bei denen es sich um Natriumkanalblocker handelt, löste in beiden Mausmodellen epileptische Anfälle aus – ein Phänomen, welches auch bei Patienten mit einer pathogenen HCN1-Variante beobachtet wurde. Aufzeichnungen von interiktalen Elektrokortikogrammen (ECoG) zeigten bei GD-Mäusen reduzierte Gamma-Oszillationen während des REM-Schlafs. Darüber hinaus wurden bei Tiefenaufnahmen des Hippocampus in der CA1-Region stratum pyramidale (SP) bei wachen, kopffixierten GD-Mäusen im Mobile HomeCage (MHC) ebenfalls reduzierte Gamma-Oszillationen während der immobilen Phase festgestellt, sowie verringerte Ripple-Oszillationen. Diese Ergebnisse deuten auf eine zugrundeliegende Interneuronopathie bei GD-Tieren hin. Da HCN1-Kanäle im Soma und in distalen Dendriten von Pyramidenzellen exprimiert werden, resultiert die G380D-Mutation in einer verringerten HCN1-Proteinexpression im Hippocampus, und in vitro-Studien haben ein verringertes Feuern von Aktionspotenzialen in diesen Neuronen gezeigt. Dies wurde durch weitere Analysen von einzelnen Neuronen in vivo bestätigt, welche ebenfalls verringertes Aktionspotential-Feuerverhalten in Pyramidenzellen im SP aufwiesen. Darüber hinaus ist HCN1 in den terminierenden Axonen von parvalbumin-positiven (PV+) Interneuronen zu finden. Vorläufige Ergebnisse deuten darauf hin, dass PV+ Interneurone in GD-Mäusen und in Wildtyp (WT)-Kontrolltieren ein ähnliches Feuerverhalten zeigten, wobei hier mögliche Defizite bei der Feed-Forward-Hemmung vermutet werden. Um die Rolle der HCN1-Dysfunction in Interneuronen bei GD-Tieren weiter zu untersuchen, wurde eine neue Mauslinie erzeugt, bei denen die G380D-Mutation von loxP-Seiten flankiert ist, was die konditionale, cre-Rekombinase-vermittelte Entfernung des betroffenen Allels ermöglichte. Durch die Verwendung von Gad2-cre-Mäusen wurde das GD-Allel in allen GABAergen Neuronen entfernt. Diese Mäuse (GDGAD) zeigten weiterhin lokomotorische Hyperaktivität, sowie reduzierte Gamma-Oszillationen im REM-Schlaf, wiesen jedoch keine spontanen epileptischen Anfälle auf. Zusammenfassend unterstützen diese Ergebnisse unsere Hypothese und liefern überzeugende Hinweise auf eine Interneuronopathie bei GD-Mäusen.

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