Jacob, Florence (2016). Cell death and transcriptional signalling mediated by the coiled-coil domain of the barley resistance protein MLA. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Plants rely entirely on innate immunity to prevent infection by pathogens. Extracellular perception of evolutionarily conserved pathogen/microbe-associated molecular patterns (P/MAMP) by membrane-resident pattern recognition receptors (PRRs) leads to pattern-triggered immunity (PTI). Host-adapted pathogens intercept PRR-mediated immunity by delivering effectors into host cells. These polymorphic effectors can be recognized by intracellular immune receptors of the nucleotide-binding domain leucine-rich repeat (NLR) family. Upon effector recognition, NLRs trigger a rapid immune response, termed effector-triggered immunity (ETI), which is typically associated with a host cell death response. In barley, the NLR MLA confers ETI against the pathogenic powdery mildew fungus, Blumeria graminis f. sp. hordei. Although MLA orthologues are present only in the Triticeae family of monocotyledonous plants, barley MLA is functional in transgenic dicotyledonous A. thaliana, indicating that the underlying disease resistance mechanism has been evolutionarily conserved for at least 150 Mya in monocot and dicot plants. In dicotyledonous Nicotiana benthamiana, transient gene expression of the coiled-coil (MLACC) domain, consisting of the N-terminal 160 amino acids of the MLA receptor, was sufficient to activate a cell death response, raising the possibility that MLA initiates a conserved signalling mechanism through the MLACC domain. This thesis aimed at identifying signalling mechanism(s) acting downstream of the MLACC module in transgenic A. thaliana. Conditional MLACC expression triggered immune-related responses, characterized by a rapid onset of massive changes in gene expression at ~2 h post induction (hpi), followed by cell death at ~4 hpi. These MLACC–triggered responses are retained in A. thaliana plants simultaneously lacking the immune components PAD4, SAG101, PEN2, and all major defence phytohormones, i.e. ethylene, jasmonic acid, and salicylic acid. A comparison of time-resolved and genome-wide transcript profiles in MLACC-expressing transgenic plants with expression profiles induced during ETI and PTI by endogenous A. thaliana NLRs or PRRs revealed at early time points highly similar patterns. This suggests that early signalling mediated by MLACC, ETI, and PTI converges on a common transcriptional machinery that activates immune response genes, implying that the barley MLACC domain is sufficient to stimulate an ETI-like response in A. thaliana. This also suggests that activation of these immune response genes can occur independently of PTI. Most (> 74.7%) of the 562 genes that were significantly upregulated at 2 hpi in MLACC-expressing plants are immediate early response genes since their induction does not depend on de novo protein synthesis, suggesting that these genes are activated by the removal of short-lived repressors. In the 5’ regulatory regions of the early induced genes, I found a striking enrichment of cis-acting motifs that serve as binding sites for Ca2+-responsive transcription factors, including the calmodulin-binding transcription activator 3 (CAMTA3) which is known to be rapidly degraded during ETI. This might explain complete inhibition of MLACC–mediated responses by the Ca2+ channel inhibitor LaCl3, which was previously also reported for several NLR-mediated and P/MAMP-triggered responses. Using chemical mutagenesis, I identified three candidate suppressor mutants of MLACC-mediated responses. Affinity purification of MLACC complexes and a yeast two-hybrid screen identified several MLACC candidate interacting proteins. Together this has revealed novel candidate components engaged in MLACC signalling.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
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TitleLanguage
Régulation transcriptionnelle et induction de la mort cellulaire par le domaine coiled-coil de MLA, protéine de résistance de l'orgeFrench
Zelltod- und transkriptionelle- Signalisierung aktiviert durch die Coiled-Coil Domäne von der Gersten-R-Protein MLAGerman
Translated abstract:
AbstractLanguage
La réponse immunitaire des plantes contre les pathogènes végétaux dépend entièrement du système immunitaire inné. La perception extracellulaire de motifs moléculaires conservés associés aux pathogènes/microbes (P/MAMP) par des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) induit un type de réponse immunitaire dénommé PTI (pattern-triggered immunity). Certains pathogènes interceptent cette réponse en injectant, dans les cellules hôtes, des protéines appelées effecteurs. Ces effecteurs, souvent polymorphiques, peuvent être détectés par des récepteurs immunitaires intracellulaires de la famille des NLR (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing). En cas de détection, les NLRs induisent une réponse immunitaire rapide, appelée ETI (effector-triggered immunity), souvent associée à la mort des cellules hôtes. Un des NLRs présents chez l’orge, MLA, confère une ETI protectrice contre Blumeria graminis f. sp. hordei, l’agent pathogène du mildiou. Bien que MLA n’ait d’homologues qu’au sein de la famille monocotylédone des Triticeae, MLA est fonctionnel dans une lignée transgénique chez l’espèce dicotylédone A. thaliana. Ceci indique que le mécanisme de résistance sous-jacent a été conservé depuis plus de 150 Ma chez les plantes dicotylédones et monocotylédones. Chez la plante dicotylédone Nicotiana benthamiana, l’expression transitoire du domaine coiled-coil (MLACC) qui correspond aux 160 premiers acides aminés en N-terminus de MLA, suffit à induire la mort cellulaire. Cette observation suggère que MLA pourrait initier un mécanisme de signalisation conservé, via son domaine MLACC. Le but de cette thèse a été de décrire le(s) mécanisme(s) de signalisation en aval de MLACC dans des lignées transgéniques d’A. thaliana. L’expression conditionnelle de MLACC induit une réponse similaire à la réponse immunitaire, et caractérisée par l’initiation d’une reprogrammation transcriptionnelle massive à ~2 h post-induction (hpi) suivie par la mort des cellules à ~4 hpi. Cette réponse est aussi induite par MLACC chez une lignée transgénique d’A. thaliana qui est simultanément dépourvue de trois composants (PEN2, PAD4 et SAG101) et des trois principales phytohormones (éthylène, acide jasmonique et acide salicylique) impliqués dans la régulation immunitaire. La comparaison des profils d’expression au cours du temps chez des plantes exprimant MLACC, avec ceux induits au cours de l’ETI et de la PTI chez A. thaliana, a révélé des patterns largement similaires lors de la réponse précoce. Ceci suggère que la signalisation initiée par MLACC, l’ETI et la PTI pourrait converger rapidement vers une machinerie de transcription commune qui active les gènes de la réponse immunitaire. De plus, ces données indiquent que le domaine MLACC de l’orge suffit à induire la réponse immunitaire normalement associée à l’ETI chez A. thaliana, et que l’activation des gènes de la réponse immunitaire peut se produire indépendamment de la PTI. La plupart (> 74.7%) des 562 gènes significativement induits à 2 hpi chez des plantes exprimant MLACC sont caractéristiques des gènes de type « immediate early response » puisqu’ils sont induits rapidement sans nécessiter la synthèse de novo de protéine. Ces gènes pourraient donc être activés par élimination d’un répresseur à courte durée de vie. Dans les régions régulatrices en 5’de ces gènes, des motifs sont fortement enrichis qui correspondent à des sites de liaison pour des facteurs de transcription sensibles au Ca2+, tels que le calmodulin-binding transcription activator 3 (CAMTA3) qui est rapidement dégradé au cours de l’ETI. Ceci pourrait expliquer l’inhibition totale de la réponse médiée par MLACC en présence de LaCl3, un inhibiteur des canaux calciques, inhibition qui a aussi été décrite par le passé concernant les réponses induites par plusieurs NLRs et P/MAMPs. J’ai effectué un crible génétique de mutants obtenus par mutagénèse chimique et identifié par ce biais trois candidats suppresseurs de la réponse médiée par MLACC. La purification des complexes protéiques associés à MLACC, ainsi qu’un crible en double-hybride chez la levure ont permis d’identifier plusieurs candidats interragissant avec MLACC. Ces approches ont révélé de nouveaux candidats impliqués dans la signalisation médiée par MLACC.French
Pflanzen sind voll und ganz auf ihr angeborenes Immunsystem angewiesen um Infektionen durch Krankheitserreger zu verhindern. Extrazelluläre Erkennung von evolutionär konservierten Pathogenen/Mikroben-assoziierten molekularen Mustern (microbe/pathogen-associated molecular patterns; P/MAMP) durch membranassoziierte P/MAMP-Rezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs), was zur sogenannten Muster-ausgelösten Immunität (pattern-triggered immunity, PTI) führt. Wirtsadaptierte Krankheitserreger hemmen diese Immunität durch die Sekretion von Effektoren in die Wirtszelle. Als Folge der Effektor-Erkennung, lösen NLRs eine rasche Immunantwort aus, welche als Effektor-ausgelöste Immunität (effector-triggered immunity, ETI) bekannt ist, und oft einen programmierten Zelltode beinhaltet. In Gerste vermitteln die MLA NLRs Resistenz gegenüber dem Mehltau Pilz Blumeria graminis f. sp. hordei. Obwohl MLA-Orthologe nur in anderen Mitgliedern der Triticeae Familie von Monokotyledonen Pflanzen bekannt sind, ist MLA in der Dikotyledonen Pflanze Arabidopsis thaliana voll funktionsfähig; was heißt, dass die MLA-zugrundeliegenden Widerstandsmechanismen über mindestens die letzten 150 Millionen Jahre evolutionär konserviert wurden. Transiente Genexpression der MLA Coiled-Coil‘ (MLACC) Domäne, bestehend aus den 160 N-terminalen Aminosäuren von MLA, in der der Dikotyledonen Pflanze Nicotiana benthamiana ist ausreichend um den Zelltod auszulösen. Daher besteht die Möglichkeit, dass die MLACC Domäne verantwortlich für die Auslösung der konservierten Signalmechanismen ist. Diese Doktorarbeit bezweckt die Signalwege zu identifizieren, welche durch das MLACC Modul in A. thaliana ausgelöst werden. Konditionale MLACC Expression führt zu immunähnlichen Reaktionen, welche durch die rasche und gewaltige Änderung der Genexpression nach ca. zwei Stunden, und den Zelltod nach ca. vier Stunden gekennzeichnet sind. Diese von MLACC ausgelösten Reaktionen werden auch in der A. thaliana Mutante ausgelöst, welche nicht-funktionelle Mutationen in PAD4, SAG101, PEN2, und den Signalwegen der wichtigsten Verteidigungs-Phytohormone Ethylen, Jasmonsäure, und Salicylsäure trägt. Der zeitabhängige Vergleich von genomweiten Transkriptionsprofilen endogener A. thaliana NLRs und PRRs mit denen von MLACC exprimierenden, transgenen Pflanzen, zeigte eine erhebliche Überschneidung der Transkriptionsprofile in den frühen Phasen nach Exprimierung und Aktivierung der jeweiligen Rezeptoren. Dies weist darauf hin, dass die frühen, durch MLACC, ETI und PTI induzierten Signalwege zu einem gemeinsamen Transkriptionsmechanismus konvergieren, welcher zur Aktivierung von Immunitätsgenen führt. Diese Resultate deuten auch darauf hin, dass die MLA Coiled-Coil Domäne von Gerste tatsächlich ausreichend ist um in A. thaliana ETI-ähnliche Reaktionen herbeizuführen, was auch bedeutet, dass diese Immunreaktionen PTI-unabhängig sind. Die meisten (>74,7%) der 562 Gene, welche ca. zwei Stunden nach Induktion der MLACC Expression signifikant höher exprimiert sind, gehören zu den sogenannten „immediate early“ Genen, da deren Expression unabhängig von der de novo Proteinbiosynthese ist. Das wiederum bedeutet, dass die Expression dieser Gene durch den Verlust eines Transkriptionsrepressors ist. In der 5‘ Regulationsregion der früh induzierten Reaktionsgenen, identifizierte ich eine auffällige Anreicherung von cis-Regulationselementen, welche als Motive für Ca2+-regulierte Signal-Transkriptionsfaktoren dienen. Einer dieser Faktoren ist der calmodulin-binding transcription-activator 3 (CAMTA3), welcher während ETI abgebaut wird. Das wiederum könnte erklären warum Reaktionen von MLACC und anderen NLRs, durch den Kalciumkanalblocker LaCl3 komplett gehemmt werden. Zusätzliche habe ich durch chemische Mutation drei Mutanten identifiziert welche auch die von MLACC herbeigeführten Reaktionen inhibieren. Eine Affinitätsreinigung von MLACC Proteinkomplexen und eine Hefe-Zwei-Hybrid-Suche (yeast-2-hybrid screen) identifizierten zusätzliche, mit MLA-assoziierende Proteine. Diese bisher nicht charakterisierten Kandidaten fungieren möglicherweise als Komponenten für die MLACC Signalwege.German
Creators:
CreatorsEmailORCID
Jacob, Florencefloh.jacob@gmail.comUNSPECIFIED
Corporate Contributors: Université Paris-Saclay
URN: urn:nbn:de:hbz:38-77517
Subjects: Life sciences
Uncontrolled Keywords:
KeywordsLanguage
plant biology, phytopathology, immune system, resistance protein, immune signalling, hypersensitive responseEnglish
biologie végétale, phytopathologie, système immunitaire, protéine de résistance, signalisation immunitaire, réponse hypersensibleFrench
Pflanzenbiologie, Phytopathologie, Immunsystem, Resistenz-Protein, Immun-Signalweg, Hypersensitive ResponseGerman
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Institute for Genetics
Language: English
Date: 25 April 2016
Date of oral exam: 25 April 2016
Referee:
NameAcademic Title
Hofmann, KayProf. Dr.
Panstruga, RalphProf. Dr.
Zeier, JürgenProf. Dr.
Refereed: Yes
URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/7751

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