Mendoza-Ferreira, Natalia (2018). Uncovering and Functional Analysis of Novel Genes and Potential Genetic Modifiers for Neuromuscular Disorders. PhD thesis, Universität zu Köln.

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The inherited Neuromuscular Disorders (NMDs) is an umbrella term that encompasses a plethora of diseases that affect the functioning of the muscles and/or their underlying nervous system control. Although individually uncommon, NMDs collectively are no longer considered rare diseases. Only in Europe, approximately 300,000 people are yearly diagnosed with one NMD. The diagnosis of a neuromuscular condition –successful in less than 50% of the cases- is often devastating to patients and their relatives. No cure is available for most of these disorders, and the few available treatments will at best delay disease progression. To find treatments and to develop methods for the early diagnosis of NMDs is a goal of highest importance, and the recent advances in the NGS technologies are the platform to reach this objective. Particularly, the implementation of WES has not only minimized the time and costs of genetic diagnostics but also provided unique opportunities for the exploration of gene function in NMDs pathogenesis. The uppermost goal of this PhD project was to identify and characterize novel NMDs-causative genes. Thereby, two novel NMD-causative genes were investigated in this thesis. First, CHP1 (Calcineurin Homologous Protein-1) was identified as a novel causing gene of Autosomal Recessive Cerebellar Ataxia (ARCA) and second, VAChT (Vesicular Acetylcholine Transporter, encoded by SLC18A3) was analysed in the context of distal Hereditary Motor Neuropathy (dHMN). Following a combination of WES and linkage analysis, we identified a biallelic 3-bp deletion (p.K19del) in CHP1 that co-segregates with a complex ARCA in two siblings of a consanguineous family exhibiting motor neuropathy, cerebellar atrophy and spastic paraparesis. CHP1 was selected as a top disease candidate since: (I) the mutation affects an amino acid highly conserved across species, (II) a point mutation in murine Chp1, causing aberrant splicing and reduced full-length Chp1 transcripts, leads to Purkinje cells loss and ataxia, (III) CHP1 assists posttranscriptional glycosylation and membrane localization of NHE1, a major neuronal Na+/H+ exchanger, (IV) KO of mouse Nhe1 cause ataxia and loss-of-function mutation in NHE1 (encoded by SLC19A1) cause ataxia-deafness Lichtenstein-Knorr syndrome (LINKS). Therefore, we hypothesized that a mutation in CHP1, as a crucial regulator of NHE1, could impair expression and targeting of the exchanger resembling the pathogenesis in mice and humans. To further uncover other families carrying CHP1 mutations, we performed a focused screening for CHP1 variants in two large ARCA and NMD cohorts (approximately 1000 exomes). No additional variants fulfilling or selection criteria were found, which emphasizes on the scarcity of CHP1 variants and the reduced tolerability of CHP1 for mutations. With the purpose to assess the functional consequences of the CHP1-K19del mutation on protein function, size exclusion chromatography (SEC), protein fractionation, 3D-protein modelling, fluorescence microscopy and in vivo zebrafish modelling were performed. We demonstrated that mutant CHP1 fails to integrate into functional protein complexes and is prone to aggregate, thereby leading to diminished levels of soluble CHP1 and reduced membrane targeting of NHE1 both in neuronal and non-neuronal cells. To analyze the pathogenic consequences of the hypomorphic CHP1-K19del mutation in vivo, we used morpholinos (MOs) to inhibit chp1 translation in zebrafish. Closely resembling the clinical features of the ARCA-affected siblings, chp1 downregulation in zebrafish led to cerebellar hypoplasia, Caudal Primary Motor Neuron (CaP-MN) defects and spastic trunk movements. All defects were ameliorated by co-injection with WT, but not mutant, human CHP1 mRNA, hence demonstrating both the specificity of the chp1-MO-induced phenotypes and validating the effect of CHP1-K19del on protein expression and/or function in vivo. Altogether, our results identified CHP1 as a novel ataxia-causative gene in humans, further expanding the spectrum of ARCA-causative loci, and highlight the crucial role of NHE1 within the pathogenesis of these disorders. Moreover, we conducted functional analyses to ascertain the functional basis of a dHMN presented by a family with cranial nerves palsy and vocal cord paresis as an initial feature of a non-progressive infantile onset dominant dHMN. WES analysis of this family led to the identification of a de novo dominant missense mutation (c.439 G>A, p.D147N) in VAChT. The mutation occurred first in the affected mother and was inherited by her affected daughter. VAChT controls the storage of the neurotransmitter Acetylcholine (ACh) by synaptic vesicles, hence it plays a fundamental role in cholinergic neurotransmission and therefore, in the plethora of processes reliant on it, which include: neuronal development and maturation, synaptic transmission and plasticity, patterning of the neuromuscular junction (NMJ), among others. The potential effect of the D147N mutation on VAChT subcellular distribution was analysed in neuron-like NSC-34 cells transiently overexpressing WT or mutant VAChT-GFP tagged proteins. No significant differences were observed in protein expression or localization, thus a detrimental effect of VAChT-D147N mutation at this level was not possible. This prompted us to further examine potential defects either in MN development and axonal outgrowth. Capitalizing once again on the advantages of the zebrafish for the modelling of human neurodegenerative disorders and further considering the evolutionary conservation of both VAChT and the D147 residue across species, the effect of WT and VAChT-D147N OE on CaP-MN outgrowth was analysed in detail. Although our findings were not conclusive at discerning the pathogenicity of the VAChT–D147N in vivo, we observed an axonal migration phenotype that could potentially underlie impairments at the NMJ level. In the light of the novel association of VAChT mutations as causative of myasthenia syndromes, follow-up studies will be performed in order to conclusively confirm the pathogenicity of the VAChT-D147N in a CaP-MN-independent context. The biological function of CHP1 was of further relevance within the scope of this doctoral project, since CHP1 is currently subject of study as potential modifier of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Pre-existing evidence from our research group indicates that Chp1 downregulation –within a certain threshold- restores neurite outgrowth and impaired endocytosis (a key pathway disturbed in SMA) in Smn1-depleted NSC-34 cells. Thereupon, this thesis further aimed to validate reduction of Chp1 as potential SMA protective modifier in a zebrafish model of SMA, as a first in vivo approach. Here, we demonstrate that Chp1 downregulation ameliorates the CaP-MN axonal outgrowth defects of Smn-deficient fish larvae. These findings are in concordance with prior validation studies of two other human SMA modifiers –PLS3 and NCALD- in zebrafish, which despite their different function and mode of action (upregulation or downregulation, respectively) exert similar effects on CaP-MN morphology whereby restoring the CaP-MN phenotype of smn morphants in a highly comparable range. Altogether, our findings together with the preliminary findings aforementioned, strongly support CHP1 reduction as a promising therapeutic target for a combinatorial treatment, i.e. together with SMN restoration, counteracting SMA pathology.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:
Neuromuskuläre Erbkrankheiten (NMDs) sind ein Überbegriff für eine Vielzahl von Krankheiten, die die Funktionsfähigkeit der Muskeln und / oder der ihnen zugrunde liegenden Kontrolle des Nervensystems beeinflussen. Obwohl einzelne NMD Erkrankungen sehr selten auftreten, werden NMDs in ihrer Gesamtheit nicht als seltene Krankheit angesehen. Alleine in Europa werden jährlich ungefähr 300.000 Menschen mit einer NMD diagnostiziert. Die Diagnose einer neuromuskulären Erkrankung, die in weniger als 50% der Fälle erfolgreich ist, ist oft verheerend für die Patienten und ihre Angehörigen. Es gibt keine Heilung für die meisten dieser Erkrankungen und die wenigen verfügbaren Behandlungen können bestenfalls nur das Fortschreiten der Krankheit verzögern. Die Entwicklung von Methoden zur Früherkennung von NMDs und deren Behandlung ist deshalb ein Ziel von größter Wichtigkeit. Die jüngsten Fortschritte der NGS Technologie bieten die besten Voraussetzungen, um dieses Ziel zu erreichen. Insbesondere die Anwendung von whole exome sequencing (WES) hat nicht nur die Zeit und die Kosten der genetischen Diagnostik minimiert, sondern auch einzigartige Möglichkeiten für die Erforschung der Genfunktion bei der NMD-Pathogenese eröffnet. Das wichtigste Ziel dieser PhD-Arbeit war die Identifikation und Charakterisierung neuartiger NMD-verursachender Gene, wovon zwei in dieser Arbeit untersucht worden sind. Als Erstes wurde CHP1 (Calcineurin Homologous Protein 1) als ein neues Gen identifiziert, das die autosomal-rezessive zerebelläre Ataxie (ARCA) verursacht. Ebenso wurde VAChT (Vesicular Acetylcholine Transporter, kodiert von SLC18A3) im Kontext der distalen hereditären motorischen Neuropathie (dHMN) analysiert. In einer Kombination aus WES und Kopplungsanalyse wurde eine biallelische 3-bp Deletion (p.K19del) in CHP1 entdeckt, die mit einer komplexen ARCA bei zwei Geschwistern einer blutsverwandten Familie ko-segregiert. Diese Individuen weisen eine motorische Neuropathie, zerebelläre Atrophie und spastische Paraparese auf. CHP1 wurde aus den folgenden Gründen als krankheitsverursachendes Gen ausgewählt: (I) Die Mutation war in keiner öffentlichen Datenbank gelistet und betrifft eine Aminosäure, die in vielen Spezies hochgradig konserviert ist, (II) eine Punktmutation im murinen Chp1 verursacht anormales Spleißen und Reduktion des vollständigen Chp1 Transkripts, welches zu einem Verlust der Purkinjezellen und Ataxie führt, (III) CHP1 unterstützt die posttranskriptionale Glykolisierung und Membranlokalisierung von NHE1, einem wichtigen neuronalen Na+/H+-Austauscher, und (IV) Nhe1-Knockout im Mausmodell führt zu Ataxie und eine Funktionsverlustmutation in NHE1 (codiert von SLC19A1) verursacht das Ataxie-Taubheits-Syndrom und Lichtenstein-Knorr-Syndrom (LINKS). Aus diesen Gründen vermuteten wir, dass eine Mutation in CHP1, als entscheidender Regulator von NHE1, die Expression und Lokalisation von NHE1 beeinträchtigen würde und dies der Pathogenese in Mäusen und Menschen entsprechen würde. Um weitere Familien aufzudecken, die die CHP1-Mutation tragen, wurde ein breites Screening durchgeführt, das sich auf 2 große ARCA und NMD Kohorten fokussierte (insgesamt ungefähr 1000 Exome). Dabei wurden keine zusätzlichen Träger der Mutation gefunden, was die Seltenheit von CHP1 Varianten und die reduzierte Verträglichkeit von CHP1 Mutationen untermauert. Mit dem Ziel die funktionellen Konsequenzen der CHP1-K19del Mutation in der Proteinfunktion einzuschätzen, wurden Größenausschlusschromatographie, Proteinfraktionierung, 3D-Proteinmodellierung, Fluoreszenzmikroskopie und in vivo Zebrafisch Experimente durchgeführt. Wir zeigten, dass das mutierte CHP1 nicht in funktionelle Proteinkomplexe integriert werden kann. Ebenso neigt es zur Aggregationsbildung, was zu verminderten Konzentrationen an löslichem CHP1 und reduziertem Membran-Lokalisierung von NHE1 in neuronalen, sowie auch in nicht-neuronalen Zellen führt. Um die pathogenen Konsequenzen der hypomorphen CHP1-K19del Mutation in vivo zu analysieren, verwendeten wir Morpholinos, die die chp1 Translation im Zebrafisch herunterregulierten. Ähnlich wie bei den klinischen Merkmalen der von ARCA betroffenen Geschwister, führte die chp1 Herunterregulation im Zebrafisch zu zerebellärer Hypoplasie, Störungen in den Caudalen Primären Motoneuronen (CaP-MN), sowie zu spastischen Rumpfbewegungen. Alle Defekte wurden durch eine Injektion mit wildtypischer, nicht jedoch der mutierten humaner CHP1 mRNA verbessert. Folglich zeigte dies die Spezifität des chp1-MO-induzierten Phänotyps, sowie den Effekt der CHP1-K19del Mutation auf die Proteinexpression und/ oder -funktion in vivo. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass unsere Ergebnisse CHP1 als ein neues Ataxie-verursachendes Gen beim Menschen identifizierten. Ferner erweitern diese Ergebnisse auch das Spektrum der ARCA-verursachenden Loci und hebt die entscheidende Rolle von NHE1 in der Pathogenese dieser Erkrankung hervor. Darüber hinaus führten wir eine Analyse durch, um die funktionale Basis einer dHMN zu ermitteln, die eine Familie mit Gehirnnervenlähmung und Stimmbandparese als Ausgangsmerkmal einer nicht-progressiven infantilen dominanten dHMN zeigte. Die WES-Analyse dieser Familie führte zu der Identifizierung einer de novo dominanten Missense-Mutation (c.439 G>A, p.D147N) im VAChT, die bei der erkrankten Mutter erstmalig auftrat, und an ihre betroffene Tochter weiter verebt wurde. VAChT kontrolliert die Speicherung des Neurotransmitters Acetylcholin durch synaptische Vesikel und spielt daher eine grundlegende Rolle bei der cholinergen Neurotransmission und vielen anderen verwandten Prozessen, wie unter anderem bei der neuronalen Entwicklung und Reifung, der synaptischen Übertragung und Plastizität und bei der Strukturierung der neuronalen Endplatte (NMJ). Die mögliche Wirkung der D147N-Mutation auf die subzelluläre VAChT-Verteilung wurde in der neuronenählichen Zelllinie NSC-34 analysiert, die transiente WT oder mutierte VAChT-GFP-markierte Proteine überexpremierte. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Proteinexpression und Lokalisation beobachtet, sodass ein nachteiliger Effekt der VAChT-D147N-Mutation auf dieser Ebene nicht nachgewiesen werden konnte. Dies veranlasste uns, mögliche Defekte in der Motoneuron Entwicklung und im axonalen Auswuchs weiter zu untersuchen. Wir nutzten dafür wieder die Vorteile des Zebrafischs als Modell für humane neurodegenerative Erkrankungen und da VAChT und D147 Spezies übergreifend evolutionär konserviert sind, wurde die Wirkung von VAChT-D147N Überexpression im Vergleich von WT auf die CaP-MN-Auswüchse im Detail analysiert. Obwohl unsere Ergebnisse bei der Erkennung der Pathogenität der VAChT-D147N-Mutation in vivo nicht schlüssig gewesen sind, konnten wir in Bezug auf die neuronale Migration einen Phänotyp beobachten, der am NMJ potenziellen Beeinträchtigungen unterliegt. Im Hinblick auf die kürzlich beschriebene VAChT-Mutationen als Ursache für das Myasthene Syndrom, werden zur Zeit noch Studien durchgeführt, um die Pathogenität der VAChT-D147N-Mutation in einem CaP-MN-unabhängigen Kontext endgültig zu bestätigen. Die biologische Funktion von CHP1 war in dieser PhD-Arbeit von weiterer Relevanz, da CHP1 in einer anderen Studie derzeit als potenzielles Modifiergen der Spinalen Muskelatrophie (SMA) untersucht wird. Ergebnisse unserer Forschungsgruppe zeigen, dass eine Herunterregulation von CHP1 - in einem bestimmten Rahmen - das neuronale Wachstum und die beeinträchtigte Endozytose (ein Schlüsselmechanismus, der in SMA gestört ist) in Smn1-verminderten NSC-34 Zellen wiederherstellt. Aus diesem Grund war ein weiteres Ziel dieser Doktorarbeit, die Reduktion von CHP1 als potenzielle SMA-Protektion im Zebrafisch-Modell als ersten in vivo Ansatz zu validieren. Hier zeigten wir, dass die Chp1 Herunterregulation den axonalen Auswuchs der CaP-MN von Zebrafischen mit Smn-Mangel verbesserte. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien von zwei weiteren humanen SMA-Modifiergenen - PLS3 und NCALD - im Zebrafischmodell überein, welche trotz ihrer unterschiedlichen Funktion und Wirkungsweise (z.B. Hochregulation für PLS3 neu aufgekommene Assoziation einer und Herunterregulation für Ncald), ähnliche Effekte auf die CaP-MN-Morphologie ausüben und den CaP-MN-Phänotyp von smn-Morpholino behandelten Zebrafischen wiederherstellten. Insgesamt weisen unsere Ergebnisse zusammen mit weiteren vorläufigen Resultaten darauf hin, dass CHP1-Herunterregulation ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für eine kombinatorische Behandlung zusammen mit einer SMN-Hochregulation darstellt, um der SMA-Pathologie entgegen zu wirken.German
Mendoza-Ferreira, Natalianatalia.mendoza-ferreira@uk-koeln.deUNSPECIFIED
URN: urn:nbn:de:hbz:38-82653
Subjects: Natural sciences and mathematics
Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:
Whole Exome Sequencing, Neuromuscular Disorders, Ataxia, distal neuropathies, Spinal Muscular Atrophy, Zebrafish model.English
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Institute for Genetics
Language: English
Date: February 2018
Date of oral exam: 12 December 2017
NameAcademic Title
Wirth, BrunhildeProf. Dr.
Rugarli, ElenaProf. Dr.
Büschges, AnsgarProf. Dr.
Related URLs:
Funders: FP7/2007-2013 under agreement 2012-305121 (NEUROMICS), Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC C11 and C16), Deutsche Forschungsgemeinschaft (Wi945/14-2, Wi945/16-1)
Refereed: Yes


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