Fragel, Susann Marlies (2018). Functional and structural characterization of LeuO, a pleiotropic LysR-type transcription regulator in Escherichia coli. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

LeuO is a conserved LysR-type transcriptional regulator (LTTR) of global function in Escherichia coli and other Gammaproteobacteria. LeuO regulates genes related to pathogenicity and stress adaptation, many of which are co-regulated by the nucleoid-associated global repressor protein H-NS. Therefore, LeuO is considered a general H-NS antagonist. LTTRs typically are tetramers that consist of two dimeric N-terminal DNA-binding domains (DBDs) and two dimeric C-terminal effector-binding domains (EBDs). Many LTTRs described so far require an effector which induces structural changes that lead to alteration of the LTTR activity in repression or activation of specific target genes. However, the regulation of LeuO activity and its structural features are poorly understood. In this work, I characterized the CRISPR-associated cas promoter as the most sensitive reporter for monitoring LeuO activity. Using this reporter nine LeuO mutants were identified in a genetic screen that render LeuO hyperactive. The solved crystal structures of the EBDs of wild-type LeuO and one of the hyperactive mutants (Serine 120 to aspartic acid exchange) revealed that all mutations causing hyperactivity localize to the dimerization interface of the EBD. Comparison and superposing of the structures of the wild-type and S120D EBDs suggests that the mutation of S120D induces a structural change that mimics an effector-bound state. This structural change is presumed to transmit to the arrangement of the DBDs and changes the binding to the DNA. DNase I footprinting of the cas promoter region presented here revealed a highly specific DNA-binding and a more distinct DNA-binding pattern of the S120D mutant compared to the wild-type LeuO. A detailed analysis of these footprints unraveled a “core-site” of palindromic sequence, which allowed the definition of a specific DNA-binding sequence motif for LeuO. The data indicate that LeuO might regulate a different set of target genes when an effector is bound. This is relevant in understanding the molecular mechanism of transcriptional regulation by LeuO and the role of LeuO as a global regulator.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:
AbstractLanguage
LeuO ist ein konservierter LysR-Typ Transkriptionsregulator (LTTR) in Escherichia coli und anderen Gammaproteobakterien. LeuO reguliert Gene, die unter anderem für Pathogenität und Stressantworten verantwortlich sind. Viele der LeuO-regulierten Gene werden durch das globale Repressorprotein H-NS reprimiert und co-reguliert. Daher wird LeuO als globaler Antagonist von H-NS angesehen. LTTRs regulieren ihre Zielgene typischerweise als Tetramere, die sich aus zwei Dimeren der N-terminalen DNA-Bindungsdomänen (DBDs) und zwei Dimeren der C-terminalen Effektorbindungsdomänen (EBDs) zusammensetzen. Viele der bisher beschriebenen LTTRs benötigen einen Effektor, der strukturelle Veränderungen induziert. Diese strukturellen Veränderungen führen zur Änderung der DNA-Bindung des LTTR und ermöglichen die Aktivierung oder Repression spezifischer Zielgene. Die Regulation der LeuO Aktivität und deren strukturelle Merkmale sind jedoch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde der CRISPR-assoziierte cas Promotor als ideales Reporter identifiziert, da er sensitiv Veränderungen der LeuO-Aktivität abbildet. Mit diesem Reporter wurden in einem genetischen Screen neun hyperaktive Mutanten von LeuO identifiziert, welche den Reporter bei basaler Expression voll aktivieren. Die gelösten Kristallstrukturen der EBDs des wild-typischen LeuO und der hyperaktiven Ser120Asp Mutante zeigen, dass die Mutationen, die Hyperaktivität bewirken, in der Dimerisierungsoberfläche der EBD lokalisiert sind. Eine Überlagerung der Strukturen der EBDs deutet darauf hin, dass die S120D-Mutation eine strukturelle Veränderung induziert, welche einen Effektor-gebundenen Zustand nachahmt. Diese strukturelle Veränderung kann sich dann auf die sterische Anordnung der DBDs übertragen und somit die DNA-Bindeeigenschaften beeinflussen. Eine DNase I Footprint Analyse der LeuO-Bindestellen in der Region des cas Promotors zeigt eine hochspezifische DNA-Bindung der LeuO Mutante (S120D), welche außerdem im Vergleich zum wild-typischen LeuO ein deutlicheres Bindemuster an die DNA zeigt. Eine detaillierte Analyse dieses Bindemusters deckte eine "Core-Site" auf, welche im Weiteren die Definition eines palindromischen DNA-Bindemotifs ermöglichte. Die Daten deuten darauf hin, dass LeuO möglicherweise eine andere Gruppe von Zielgenen reguliert, wenn ein Effektor gebunden ist, der strukturelle Veränderungen des Proteins auslöst. Die Analyse von hyperaktiven Mutanten, welche vermutlich eine Effektor-gebundene Form abbilden, kann zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Transkriptionsregulation durch LeuO beitragen.German
Creators:
CreatorsEmailORCID
Fragel, Susann Marliessusann_fragel@yahoo.deUNSPECIFIED
URN: urn:nbn:de:hbz:38-85853
Subjects: Natural sciences and mathematics
Life sciences
Uncontrolled Keywords:
KeywordsLanguage
LeuO, LysR-type transcriptional regulator, Escherichia coliEnglish
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Institute for Genetics
Language: English
Date: 27 June 2018
Date of oral exam: 5 September 2018
Referee:
NameAcademic Title
Schnetz, KarinProf. Dr.
Gehring, NielsProf. Dr.
Becker, AnkeProf. Dr.
Refereed: Yes
URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8585

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