Öcal, Sinan (2018). The HSP47 - Procollagen Interaction: Mechanism of pH-Dependent Client Release and Development of Antifibrotic Inhibitors. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Collagens are a multifaceted superfamily of proteins which constitute the principal structural component of the extracellular matrix (ECM) of metazoan organisms. Intimately tied to ECM architecture and dynamics, collagens are involved in a multitude of processes such as cell adhesion and migration, angiogenesis, morphogenesis, the immune response and cancer progression. The biosynthesis of these large and complex molecules is reliant on a finely tuned machinery, disruptions of which is often causative to severe disease. Heat-shock protein 47 (HSP47), the molecular chaperone of collagen, plays a central role in ensuring proper processing and trafficking of collagens as well as the protection of the endoplasmatic reticulum (ER) from stress induced by aggregation and accumulation of its client. Although HSP47 has been first described more than 20 years ago, critical aspects of its function are still shrouded in mystery, ranging from why it is a member of the serpin superfamily of proteins to whether its client repertoire includes all types of collagen. The rather recently solved crystal structure of HSP47 in complex with a collagen model peptide has provided a new impetus for answering the many open questions. One of these is how client-release is achieved: untypical for chaperones, HSP47 function is not coupled to nucleotide hydrolysis or exchange, but governed by the gradual decrease in pH along the secretory pathway. The mechanism by which the pH-shift induces client release is unclear. In this work, it was investigated whether this process is based on conformational re-arrangements, more subtle distortions of the binding site or electrostatic repulsion. Of particular interest were the 14 histidine residues in HSP47, which have long been considered as potential trigger residues, since their imidazole side-chains can serve as a proton acceptor at physiological pH. Systematic analysis of these histidines in context of this thesis has revealed that His273 and His274, located at the fringe of the binding interface, exert considerable influence on the pH-sensitivity of the HSP47 - collagen complex. Other histidines have also been found to be important for the interaction; most notably, His238 was shown to be an essential actor in the pre-arrangement of key residues in a client-binding competent conformation. Over the recent years, studies using gene ablation via siRNA have shown that interfering with the HSP47 - collagen complex can resolve a variety of fibrotic diseases. HSP47 has thus enjoyed increasing attention as a potential target for anti-fibrotic drugs. In light of this, one part of this thesis has focused on developing a fluorescence based, high-throughput screening compatible assay to be utilized for the identification of novel inhibitors of the HSP47 - collagen interaction. Interrogation of a compound library using the assay has yielded 4 potential inhibitor candidates, at least one of which having shown promising results in initial validation studies.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:
AbstractLanguage
Kollagene sind eine äußerst vielseitige Superfamilie von Proteinen, welche primär als strukturgebende Hauptkomponente der Extrazellulären Matrix (EM) von Metazoen bekannt sind. Aufgrund ihrer zentralen Rolle beim Aufbau und der Dynamik der EM sind Kollagene an einer Vielzahl an unterschiedlichen Prozessen wie z.B. der Zelladhäsion, Zellmigration, Angiogenese, Morphogenese, Immunantwort oder Krebsprogression beteiligt. Die Biosynthese dieser großen, stark post-translational modifizierten Proteine wird durch eine fein aufeinander abgestimmte Maschinerie bewerkstelligt. Die Komplexität dieser Maschinerie äußert sich durch ihre Anfälligkeit gegenüber Störungen, welche oft zur Entstehung von schwerwiegenden Defekten und Krankheiten führen. Das molekulare Chaperon von Kollagen, Hitzeschockprotein 47 (HSP47), spielt hierbei eine entscheidende Rolle und gewährleistet sowohl die fehlerfreie Synthese und den Transport von Kollagenen als auch den Schutz des Endoplasmatischen Retikulums (ER) vor durch Aggregation und Akkumulation von Kollagenen bedingtem Stress. Obwohl HSP47 seit mehr als zwei Jahrzehnten Forschungsgegenstand ist, sind viele, teilweise grundlegende Aspekte seiner Funktion immer noch unbekannt; es ist z.B. unbekannt, welchen Vorteil die Serinproteasestruktur für die Proteinfunktion bringt, oder ob alle Kollagentypen zum Substratrepertoire gehören. Die kürzlich gelöste Kristallstruktur von HSP47 im Komplex mit einem Kollagenmodellpeptid hat der Beantwortung der offenen Fragen neuen Anstoß gegeben. Eine betrifft den Mechanismus der Substratfreisetzung: untypisch für Chaperone wird die Funktion von HSP47 nicht durch Austausch oder Hydrolyse von Nukleotiden reguliert, sondern durch die graduelle Abnahme des pH-Wertes im sekretorischen Weg. Die molekularen Details dieser pH-induzierten Substratfreisetzung sind ungeklärt und wurden im ersten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht. Ausgehend von der Kristallstruktur und Phylogenetischen Daten wurden gezielt HSP47-Punktmutanten generiert und deren Bindung an Kollagenmodellpeptide mittels Biolayerinterferometrie kinetisch quantifiziert. Besonderes Interesse galt hierbei den 14 Histidinresten von HSP47, welche Aufgrund Ihrer Fähigkeit, bei physiologischen pH-Werten Protonen aufnehmen zu können, als potentielle Auslöser einer Substratfreisetzung in Betracht kamen. Eine systematische Analyse dieser Aminosäuren enthüllte dass His273 und His274, am Rande der Interaktionsfläche gelegen, großen Einfluss auf die pH-Sensitivität der HSP47 - Kollagen Interaktion ausüben. Andere Histidinreste wurden ebenfalls als wichtige Komponenten der Interaktion ausgemacht, wie z.B. His238, welches bei der korrekten Ausrichtung von für die Bindung essentiellen Aminosäureseitenketten eine Rolle spielt. Versuche, HSP47 bei leicht saurem Milieu zu Kristallisieren waren Aufgrund der verminderten Stabilität des Proteins unter solchen Bedingungen nicht erfolgreich; somit steht eine umfassende, strukturelle Erklärung des Substratfreisetzungsmechanismus noch aus. In den letzten Jahren haben mehrere Studien gezeigt, dass Genablation von HSP47 mittels siRNA zu einer deutlichen Verbesserung bis hin zur Aufhebung von fibrotischen Krankheiten führen kann. HSP47 wurde dadurch als ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung antifibrotischer Medikamente erkannt. Vor diesem Hintergrund wurde in dieser Arbeit ein auf Fluoreszenz basierender Assay entwickelt, welcher mittels eines Hochdurchsatzverfahens zur Identifizierung neuartiger Inhibitoren des HSP47 - Kollagen Komplexes herangezogen werden kann. Der Assay wurde genutzt, um aus einer 40.000 Chemikalien umfassenden Substanzbibliothek heraus 4 potentielle Inhibitorkandidaten zu identifizieren, von welchen mindestens eine Substanz in Validationsexperimenten vielversprechende Ergebnisse lieferte.German
Creators:
CreatorsEmailORCID
Öcal, Sinanoecal.sinan@gmail.comUNSPECIFIED
URN: urn:nbn:de:hbz:38-90069
Subjects: Chemistry and allied sciences
Life sciences
Uncontrolled Keywords:
KeywordsLanguage
HSP47, Collagen, Protein interaction studies, High-throughput screeningUNSPECIFIED
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Institute for Biochmemistry
Language: English
Date: 12 November 2018
Date of oral exam: 13 November 2017
Referee:
NameAcademic Title
Baumann, UlrichProf. Dr.
Niefind, KarstenProf. Dr.
Refereed: Yes
URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9006

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