Universität zu Köln

Simard, Marie-Lune (2018). Nitrotetrazolium Blue Exclusion Assay (NBTx). Demonstration of a novel assay to quantify cytochrome c oxidase deficiency. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Respiratory chain impairment, interfering with energy production in the cell, is a major underlying cause of mitochondrial diseases. Yet, the surprising variety of clinical symptoms and the wide gap between ages of onset, as well as the involvement of mitochondrial impairment in ageing and age-related diseases continues to challenge our understanding of the pathogenic processes. The explanation for this complexity likely lays in the multiple roles of mitochondria in cellular function, a unique set of requirements for each cell types, and a convergence of a complex dual genetic predispositions and environmental factors. As the defined gene defect poorly predicts clinical manifestations in humans it remains essential to carefully assess the etiopathology of mitochondrial diseases. Given the heterogeneity of mitochondrial activity in cells and their functional relevance, clarifying the contribution of mitochondrial metabolic dysfunction at the cellular level is fundamental. For this purpose, we developed a novel enzyme histochemical method that enables precise quantification of COX deficiency in fresh-frozen tissues. I demonstrate that the loss of oxidative activity is detected at very low levels – an achievement unequaled by previous techniques and opens up new opportunities for the study of early disease processes or comparative investigations. Moreover, human biopsy samples of several genotypic origins were used and the successful detection of COX-deficient cells suggests a broad application for this new method. Lastly, the assay can be adapted to a wide range of tissues in the mouse and extends to other animal models, illustrated here with the fruit fly, Drosophila melanogaster. Overall, the new assay enables the quantification and precise mapping of single cells presenting impaired COX activity with the full extent of COX deficiency in tissues being made visible. This work makes the demonstration that the new enzyme histochemistry assay is a reliable tool for exposing COX-deficient cells and thereby expends new possibilities for future investigation.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Schädigungen der Atmungskette, welche die zelluläre Energiegewinnung beeinträchtigen, sind eine zentrale Ursache mitochondrialer Erkrankungen. Unser Verständnis der zugrundeliegenden pathogenen Prozesse wird jedoch durch die überraschende Vielfalt klinischer Symptome und das unterschiedliche Manifestationsalter mitochondrialer Erkrankungen sowie durch die Beeinträchtigung mitochondrialer Funktionen während des Alterungsprozesses und bei altersbedingten Erkrankungen fortwährend in Frage gestellt. Eine mögliche Erklärung für die Komplexität mitochondrialer Erkrankungen liegt möglicherweise in den vielfältigen Aufgaben der Mitochondrien und den einzigartigen metabolischen Anforderungen bestimmter Zelltypen begründet. Des Weiteren spielt vermutlich das Zusammenspiel von genetischen Faktoren zweier Genome, bestimmten Prädispositionen und Umweltfaktoren eine Rolle. Da genetische Defekte klinische Manifestationen im Menschen nur bedingt prognostizieren, ist es von zentraler Bedeutung, den Krankheitsverlauf mitochondrialer Erkrankungen sorgfältig einzuschätzen und zu beurteilen. Da die Aktivität der Mitochondrien und deren funktionelle Bedeutung abhängig vom Zelltyp sehr heterogen ist, ist es von fundamentalem Interesse, das Ausmaß einer mitochondrialen metabolischen Dysfunktion auf zellulärer Ebene aufzuklären. Aus diesem Grund haben wir eine neuartige enzymhistochemische Methode entwickelt, die eine präzise Quantifizierung der COX-Defizienz in frischeingefrorenen Geweben ermöglicht. Der Verlust der oxidativen Aktivität kann dabei bereits bei einem geringen Schweregrad nachgewiesen werden – die hier beschriebene Sensitivität der Methode übertrifft alle bisher beschriebenen Techniken und eröffnet neue Möglichkeiten, die frühen Stadien mitochondrialer Erkrankungen zu analysieren und vergleichende Untersuchungen zu machen. Darüber hinaus wurden humane Biopsien unterschiedlicher genotypischer Herkunft untersucht und die erfolgreiche Detektion COX-defizienter Zellen weist auf eine breite Anwendungsmöglichkeit dieser neuartigen Methode hin. Zusätzlich dazu kann diese Methode für eine Reihe unterschiedlicher Gewebe angepasst werden und auch in anderen Tiermodellen, wie hier in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster gezeigt, angewendet werden. Insgesamt gesehen ermöglicht diese neue Färbemethode die genaue Quantifizierung und die präzise Zuordnung einzelner COX-defizienter Zellen und macht somit das volle Ausmaß der COX-Defizienz im Gewebe sichtbar. Diese Arbeit demonstriert, dass die hier beschriebene neue enzymhistochemische Färbemethode eine verlässliche Technik darstellt, um COX-defiziente Zellen mit hoher Sensitivität zu identifizieren und bietet somit neue Anwendungsmöglichkeiten für zukünftige Analysen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Simard, Marie-Lune msimard@age.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-91967
Date:	2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language enzyme histochemistry English mitochondria English cytochrome c oxidase deficiency English
Date of oral exam:	5 September 2018
Referee:	Name Academic Title Riemer, Jan Prof. Dr. Wiesner, Rudolf Prof. Dr.
Funders:	Max Planck Institute
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9196