Universität zu Köln

Diesner, Max Raoul ORCID: 0000-0002-9485-7894 (2018). Qualitive and quantitive mass spectrometric analysis of neuroactive substances from single insect neurons. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Organisms need to constantly adapt their behavior to the changing environment as well as react towards changes in their internal state. The nervous system perceives and processes such stimuli and coordinates the corresponding reactions of the body. This system is based on regulated cell-cell communication, utilizing a wide range of different chemical signaling molecules and receptors. If one wants to fully grasp how neural circuits process, modulate and relay incoming information, then the involved neuroactive substances, their cellular distribution, temporal and quantitative dynamics have to be analyzed on single cell resolution. Single cell mass spectrometry (SCMS) allows the interrogation of chemical profiles from individual cells, including neuroactive substances such as neuropeptides and biogenic amines. Matrix assisted laser desorption/ionization – time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has established itself as a fast and reliable tool for the analysis of neuropeptides from single neurons of invertebrates and vertebrates alike. However, the detection of small signaling molecules, such as biogenic monoamines, by MALDI-TOF SCMS has been challenging. Biogenic monoamines play key roles in orchestrating and modulating neural circuits, therefore a MALDI-TOF SCMS based method for their detection and quantification is highly desirable. Additionally, biogenic monoamines can be co-localized with neuropeptides. Therefore the development of a MALDI-TOF SCMS based method capable of detecting both neuroactive substances would help to reveal such overlapping expression profiles. In the current thesis, I focused on the development of a MALDI-TOF SCMS based method that allows the detection and quantification of biogenic monoamines from single somata of insect neurons. The study focused on the insect octopaminergic/tyraminergic system, with an emphasis on octopamine (OA), which is considered to be homologous to the vertebrate noradrenalin/adrenalin system. By using chemical derivatization of amine moieties of OA and tyramine (TA) and an optimized sample preparation, I was able to lower the respective detection limits to single cell concentrations. Additionally, I could show that the chemical derivatization does not interfere with the detection of neuropeptides from the same sample, hence allowing the simultaneous detection of both substance classes. Further, I could show that absolute quantification of OA and TA is possible from single cell sample volumes using isotopically labeled synthetic standards. I used the developed protocol for the qualitative and quantitative analysis of OA/TA from genetically labeled and manually microdissected somata of interneurons from the fruit fly Drosophila melanogaster. Using the newly developed approach, I analyzed intracellular OA/TA ratios, compared somatic OA titers between sexes and two different OAergic cell clusters and revealed that prolonged cooling of animals has an increasing effect on detectable OA titers in the analyzed neurons. Furthermore, I used the developed protocol to analyze changes in somatic OA titers of aggression modulating OAergic neurons from the gnathal ganglion in socially naive and experienced adult male D. melanogaster. I could show that the somatic OA titer increases in these neurons when flies had social contact with the same sex compared to naive flies, which is possibly mediated by an input from pheromone detecting gustatory receptor neurons. To my knowledge, this is the first study to report a quantified increase of a somatic biogenic monoamine titer detected directly from individual isolated neurons of intact insect brains between two behavioral states by mass spectrometric analysis. In a collaborative study, I employed the developed protocol to intracellular recorded descending dorsal unpaired median neurons from the Indian stick insect Carausius morosus and was able to confirm that these neurons contain OA and TA and thus could be OAergic. Finally, as a starting point in an effort to create a map of neuropeptidergic neurons and their repertoire of neuroactive substances in adult D. melanogaster, I was involved in the analysis of single genetically labeled neuropeptidergic neuron somata using MALDI-TOF SCMS. In summary, we could describe a total of 10 different cell types characterized by their expressed neuropeptides and their location in the CNS. Future studies will focus on analyzing these cell types towards potential co-localized aminergic transmitters using the developed protocol.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Qualitative und quantitative massenspektrometrische Analyse von neuroaktiven Substanzen aus einzelnen Insekten Neuronen. German
Translated abstract:	Abstract Language Organismen müssen ihr Verhalten ständig an die sich verändernde Umwelt anpassen sowie auf Veränderungen in ihrem physiologischen Zustand reagieren. Das Nervensystem nimmt solche Reize wahr, verarbeitet sie und koordiniert die entsprechenden Reaktionen des Körpers. Dieses System basiert auf einer geregelten Zell-Zell-Kommunikation, bei der eine Vielzahl verschiedener chemischer Signalmoleküle und Rezeptoren zum Einsatz kommen. Um zu verstehen, wie neuronale Schaltkreise eingehende Informationen verarbeiten, modulieren und weiterleiten, müssen die beteiligten neuroaktiven Substanzen auf zellulärer Ebene charakterisiert und ihre zeitliche und quantitative Dynamik auf Einzelzellnivaeu analysiert werden. Die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) ermöglicht die Analyse von chemischen Profilen einzelner Zellen, einschließlich neuroaktiver Substanzen wie z.B. Neuropeptide und biogene Monoamine. Die matrixgestützte Laser Desorption/Ionisation – Flugzeit Massenspektrometrie (matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry; MALDI-TOF MS) hat sich als schnelle und zuverlässige Methode zur Analyse von Neuropeptiden aus einzelnen Neuronen von Invertebraten und Vertebraten etabliert. Die Detektion von kleinen Signalmolekülen, wie z.B. biogenen Monoaminen, durch MALDI-TOF SCMS stellt jedoch bis heute eine analytische Herausforderung dar. Da biogene Monoamine eine Schlüsselrolle bei der Orchestrierung und Modulation neuronaler Schaltkreise haben, ist eine MALDI-TOF SCMS gestützte Methode für deren Nachweis und Quantifizierung äußerst erstrebenswert. Biogene Monoamine können zu dem mit Neuropeptiden kolokalisiert seien. Somit würde eine neu entwickelte durch MALDI-TOF SCMS gestützte Methode, mit der ein Nachweis beider neuroaktiven Substanzklassen aus einer Zellprobe möglich ist, es deutlich erleichtern entsprechend überlappende Expressionsmuster nachzuweisen. In der vorliegenden Arbeit konzentrierte ich mich auf die Entwicklung einer MALDI-TOF SCMS basierten Methode, die den Nachweis und die Quantifizierung von biogenen Monoaminen aus einzelnen Insektenneuronen ermöglicht. Die Studie konzentrierte sich auf das octopaminerge/tyraminerge System von Insekten, mit dem Schwerpunkt auf Octopamin (OA), das als homolog zum Noradrenalin/Adrenalin-System der Wirbeltiere gilt. Durch die chemische Derivatisierung der Aminogruppe von OA und Tyramin (TA) und eine optimierte Probenvorbereitung konnte ich die jeweiligen Nachweisgrenzen auf Einzelzellkonzentrationen senken. Zudem konnte ich zeigen, dass die chemische Derivatisierung den Nachweis von Neuropeptiden aus derselben Probe nicht stört und somit den gleichzeitigen Nachweis beider Substanzklassen ermöglicht. Außerdem konnte ich zeigen, dass die Quantifizierung von OA und TA aus Einzelzellprobenvolumina mit isotopenmarkierten synthetischen Standards möglich ist. Ich entwickelte das Protokoll zur qualitativen und quantitativen Analyse von OA/TA mittels genetisch markierten und manuell mikrodissektierten Somata von Interneuronen der Taufliege Drosophila melanogaster. Mit dem neu entwickelten Ansatz untersuchte ich intrazelluläre OA/TA Verhältnisse, verglich somatische OA-Titer zwischen den Geschlechtern sowie zwei verschiedenen OAergen Zellclustern und zeigte, dass eine Kühlung der Tiere vor der Präparation zu einem Anstieg der nachweisbaren OA-Titer in den analysierten Neuronen führt. Darüber hinaus habe ich das entwickelte Protokoll verwendet, um Veränderungen in somatischen OA-Titern von aggressionsmodulierenden OAergen Neuronen aus dem gnathalen Ganglion in sozial naiven und erfahrenen erwachsenen männlichen D. melanogaster zu analysieren. Ich konnte zeigen, dass der somatische OA-Titer in diesen Neuronen zunimmt, wenn Fliegen sozialen Kontakt mit dem gleichen Geschlecht hatten, verglichen mit naiven Fliegen. Dies ist möglicherweise auf einen Input von gustatorische Rezeptorneuronen zurückführen welche Pheromone detektieren. Nach meiner Kenntnis ist dies die erste Studie, die einen quantifizierten Anstieg eines somatischen biogenen Monoamin-Titers zeigt, der direkt aus einzelnen isolierten Zellen eines intakten Insekten Gehirns zwischen zwei Verhaltenszuständen mittels massenspektrometrischer Analyse nachgewiesen wurde. In einem Kooperationsprojekt untersuchte ich mit Hilfe des entwickelten Protokolls intrazellulär abgeleitete dorsal ungepaarte mediane Neurone der indischen Stabheuschrecke Carausius morosus in Bezug auf ihre aminerge Zusammensetzung. Ich konnte nachweisen, dass diese Neurone OA und TA enthalten und somit OAerg seien können. Als Ausgangspunkt für die Erstellung einer Karte neuropeptiderger Neurone und ihrer Repertoires an neuroaktiven Substanzen in adulten D. melanogaster, war ich an der Analyse einzelner genetisch markierte neuropeptiderge Neuronenzellkörper mittels MALDI-TOF SCMS beteiligt. Insgesamt konnten wir 10 verschiedene Zelltypen beschreiben, die sich durch ihre Neuropeptidzusammensetzung und ihre Lage im Gehirn auszeichnen. Zukünftige Studien werden sich darauf konzentrieren, diese Zelltypen mit Hilfe des entwickelten Protokolls zur biogenen Monoamincharakterisierung auf mögliche Kolokalisierungen aminerger Transmitter zu analysieren. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Diesner, Max Raoul maxdiesner@gmx.de orcid.org/0000-0002-9485-7894 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-92782
Date:	12 November 2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Natural sciences and mathematics Chemistry and allied sciences Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language single cell mass spectrometry MALDI-TOF octopamine tyramine Drosophila melanogaster Carausius morosus neuropeptide English
Date of oral exam:	18 January 2019
Referee:	Name Academic Title Neupert, Susanne PD Dr. Krüger, Marcus Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9278