Universität zu Köln

Rashid, Khalid (2019). Microglia specific transcriptional regulation of the Translocator protein (18 kDa) (TSPO). PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Various stimuli that perturb neuronal homeostasis and cause neurodegeneration trigger microglia reactivity. The microglia reaction and the increased production of pro-inflammatory mediators is intended to protect the central nervous system, including the retina, from noxious insults and facilitate a rapid return to normal homeostasis. However, sustained and dysregulated microglia inflammatory responses can lead to robust neuropathological changes that contribute to the severity and progression of neurodegenerative diseases. In the retina, pathologically activated microglia have been shown to not only contribute to neurodegenerative processes indirectly via the release of neurotoxic substances, but also directly via the indiscriminate phagocytosis of stressed but living photoreceptors. Consistently, innumerous studies have demonstrated that microglial modulation represents an attractive therapeutic avenue to alleviate or delay neurodegenerative diseases of the retina. Translocator protein (18kDa) (TSPO) located in the outer mitochondrial membrane is acutely and specifically expressed in activated microglia during retinal pathology. Importantly, specific TSPO ligands have been shown to potently modulate microglia inflammatory responses and ameliorate light-induced photoreceptor degeneration in mice. However, understanding the regulation of TSPO expression in microglia during health and disease is paramount prior to any utilization of this protein as a therapeutic target to modulate chronic microglia inflammatory responses and alleviate retinal degeneration. The aim of the current study therefore was to carry out a detailed functional characterization of the TSPO promoter and identify genetic elements and transcription factors responsible for maintaining basal and mediating induced TSPO expression in microglia. To this end, a 2.812Kb murine Tspo promoter sequence was amplified by PCR and cloned into the promoterless pGL4.10-Basic luciferase reporter vector. Plasmids containing 5’ unidirectional deletions of the promoter were then generated by PCR. BV-2 microglia cells were transfected with the generated reporter plasmids for 24 h, and an additional 6 h in the case of lipopolysaccharide (LPS) stimulation before measuring luciferase activity. Sequence analysis was performed using Matinspector software and site-directed substitution mutagenesis was used to confirm the functional status of the putative transcription factor binding sites. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) was used to investigate binding of transcription factors to the endogenous promoter. The effect of transcription factor knockdown on Tspo promoter activity was assessed using RNAi mediated gene silencing followed by transfection with the reporter constructs and measurement of luciferase activity 24 h later. Additionally, effects of RNAi mediated gene silencing on endogenous Tspo protein levels were determined using western blot analysis. Deletion mutagenesis indicated that −845 bp upstream of the transcription initiation site was sufficient to reconstitute near maximal promoter activity in BV-2 microglia cells. Deletion of sequences extending -593 to -520, which harbour an Ap-1, Ets.2 and Nkx3.1 site which also serves as a non-canonical binding site for Sp1-family transcription factors, led to a dramatic decrease in both basal as well as LPS induced promoter activity. Further deletion of sequences extending -168 to -39, which contains four GC boxes, also significantly decreased Tspo promoter activity. Site-directed mutagenesis of Ap-1, Ets.2, Nkx3.1/Sp1/3/4 and the proximal GC boxes led to significant decreases in promoter activity. ChIP-qPCR revealed that Pu.1, Ap-1(cJun/cFos), Stat3, Sp1, Sp3 and Sp4 bind the endogenous Tspo promoter. Notably, upon LPS stimulation, the binding of these factors, with the exception of Stat3, was significantly enhanced. RNAi mediated silencing of Pu.1, cJun, cFos, Stat3, Sp1, Sp3 and Sp4 gene expression significantly diminished Tspo promoter activity while Ap1(cJun/cFos) silencing effectively blocked LPS-induced increase in Tspo protein levels. Taken together, these findings demonstrate that the consensus binding sequences for Ap-1, Ets.2, distal as well as proximal Sp1/3/4 sites must be intact for maximal basal and LPS induced Tspo promoter activity in microglia. Furthermore, the current findings indicate that LPS-mediated increase in Tspo expression is mediated, at least in part, at the transcriptional level and is accompanied by an enhanced recruitment of Pu.1, Ap-1(cJun/cFos), Sp1, Sp3, and Sp4 factors to the Tspo promoter.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Verschiedenste Stimuli, welche die neuronale Homöostase stören und neurodegenerative Erkrankungen verursachen, führen zur inflammatorischen Aktivierung von Mikrogliazellen. Mikrogliaaktivierung und die erhöhte Freisetzung von pro-inflammatorischen Signalmolekülen dienen ursprünglich dem Schutz des zentralen Nervensystems, inklusive der Netzhaut, vor schädlichen Einflüssen und ermöglichen ein rasches Wiederherstellen der gesunden Homöostase. Dauerhafte und fehlregulierte inflammatorische Reaktivität von Mikrogliazellen führt hingegen zu auffälligen neuropathologischen Veränderungen, welche die Schwere und den Verlauf neurodegenerativer Erkrankungen negativ verstärken können. In der Netzhaut tragen pathologisch aktivierte Mikroglia nicht nur indirekt, durch die Ausschüttung neurotoxischer Substanzen, sondern auch direkt, durch die fehlgesteuerte Phagozytose von geschädigten aber noch lebenden Photorezeptorzellen, zum verschlechterten Krankheitsverlauf bei. Auf diesen Beobachtungen basierend, demonstrierten bereits zahlreiche Studien die Modulation der Mikrogliaaktivität als vielversprechenden therapeutischen Weg um neurodegenerative Erkrankungen der Netzhaut zu mildern oder zu verzögern. Das Translokatorprotein (18 kDa) (TSPO) befindet sich in der äusseren Mitochondrienmembran und ist selektiv in reaktiven Mikrogliazellen während verschiedenen Netzhautdegenerationen verstärkt exprimiert. Interessanterweise konnte bereits nachgewiesen werden, dass spezifische TSPO Liganden in der Lage sind die pro-inflammatorische Mikrogliaaktivierung zu modulieren und dadurch die lichtinduzierte Photorezeptordegeneration im Mausmodell zu reduzieren. Das klare Verständnis der Regulation der TSPO Expression in Mikrogliazellen während Homöostase und Krankheit stellt eine Grundvoraussetzung für die Nutzung des Proteins als therapeutisches target im Kontext der Mikrogliaaktivierung und Netzhautdegeneration dar. Daher war das Ziel der vorliegenden Studie eine detaillierte funktionelle Charakterisierung des TSPO Promotors sowie die Identifikation von genetischen Elementen und Transkriptionsfaktoren, welche für die basale sowie induzierbare TSPO Expression in Mikrogliazellen verantwortlich sind. Zu diesem Zwecke wurde eine 2,812 kb grosse murine Tspo Promotorsequenz mittels PCR amplifiziert und in den promotorlosen pGL4.10-Basic Luciferase Reporter Vektor kloniert. Als nächstes wurden durch PCR einzelne Plasmide mit 5` Deletionen verschiedener Längen generiert. BV-2 Mikrogliazellen wurden mit den so erhaltenen Reporterplasmiden für 24 h transfiziert und nach weiterer sechsstündiger Inkubation mit Lipopolysaccharid (LPS) die Luciferaseaktivität gemessen. Sequenzanalyse wurde mittels der Software MatInspector ausgeführt und zielgerichtete Mutagenese PCR wurde angewandt um die Funktionalität der putativen Transkriptionsfaktorbindestellen nachzuweisen. Die tatsächliche Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren an den endogenen Promotor wurde mittels Chromatin Immunpräzipitation (ChIP) experimentell belegt. RNAi-vermittelte Gen-Silencing Experimente wurden zur Untersuchung des Effekts von Transkriptionsfaktor Knock-Down auf die Luziferaseaktivität der Reporterkonstrukte durchgeführt. Zusätzlich wurde die endogene Tspo Protein Menge nach diesen RNAi Gen-Silencing Experimenten mittels Western Blot analysiert. Unsere Mutageneseexperimente belegten, dass ein Abschnitt von -845 bp upstream der Transkriptionsinitiationsstelle für nahezu maximale Promotoraktivität in BV-2 Mikrogliazellen ausreichend ist. Die Deletion des Sequenzbereichs zwischen -593 und -520, welcher sowohl eine Ap-1, Ets.2 als auch Nkx3.1 Bindestelle - die auch als Bindestelle für Transkriptionsfaktoren der Sp1-Familie fungiert – enthält, führte zu einem drastischen Verlust sowohl der basalen als auch LPS induzierten Promotoraktivität. Des Weiteren führte die Deletion des Sequenzbereichs von -168 bis -39, welcher vier GC Boxen enthält, ebenfalls zu einem signifikanten Abfall der Tspo Promotoraktivität. Analog dazu führte die zielgerichtete Mutagenese der AP-1, Ets.2, Nkx3.1/Sp1/3/4 und proximalen GC Boxen ebenfalls zu starken Abschwächungen der Promotoraktivität. ChiP-qPCR Experimente belegten anschliessend die tatsächliche physikalische Bindung der Faktoren Pu.1, Ap-1(cJun/cFos), Stat3, Sp1, Sp3 und Sp4 am endogenen Tspo Promotor. Bemerkenswerterweise war die Bindung aller dieser Faktoren (mit Ausnahme von Stat3) nach LPS-Stimulation siginifikant verstärkt. RNAi-vermitteltes Gen-Silencing von Pu.1, cJun, cFos, Stat3, Sp1, Sp3 und Sp4 reduzierte die Tspo Promotoraktivität signifikant, wohingegen ein Silencing von Ap1(cJun/cFos) effektiv die LPS vermittelte Tspo Induktion blockierte. Zusammenfassend demonstrieren unsere Ergebnisse, dass die Konsensusbindesequenzen für Ap-1, Ets.2 und der distalen wie proximalen Sp1/3/4 Bindestellen für maximale basale und LPS induzierte Tspo Promotor Aktivität in Mikrogliazellen vorhanden und intakt sein müssen. Zusätzlich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass der LPS induzierte Anstieg der Tspo Expression zumindest teilweise auf dem transkriptionellen Weg vermittelt wird und mit einer erhöhten Rekrutierung der Transkriptionsfaktoren Pu.1, Ap-1(cJun/cFos), Sp1, Sp3, und Sp4 zum Tspo Promotor einhergeht. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Rashid, Khalid khalid.rashid@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Creators:	Uniklinik Köln, Augenklinik, Exp. Immunologie des Auges
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-93944
Date:	26 February 2019
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Microglia English BV-2 cells English Translocator protein 18 kDa (TSPO) English Transcriptional regulation English Lipopolysaccharide English ARPE-19 cells English Differential regulation English
Date of oral exam:	19 February 2019
Referee:	Name Academic Title Baumann, Ulrich Prof. Dr. Nürnberg, Peter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9394