Long-term Growth Arrest and Regrowth of Human Dermal Fibroblasts after 8-MOP plus UVA Treatment � Implications for Stress-Induced Premature Senescence and Replicative Cellular Senescence

Ma, Wenjian (2003). Long-term Growth Arrest and Regrowth of Human Dermal Fibroblasts after 8-MOP plus UVA Treatment � Implications for Stress-Induced Premature Senescence and Replicative Cellular Senescence. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Following psoralen photoactivation (PUVA) human dermal fibroblasts undergo long-term growth arrest as well as morphological and functional changes reminiscent of cellular senescence. In the absence of molecular data what constitutes normal senescence, it has been difficult to decide whether these PUVA-induced changes reflect cellular senescence or rather a mimic thereof. By contrast to replicative senescence, PUVA-induced growth arrest was reversible. Ninety to 120 days post PUVA treatment, cells start to regrow. As cellular senescence has been proposed to serve as a barrier for tumorigenesis, the escape from senescence was studied in regard to immortalization and transformation. Regrowing fibroblasts did not show telomerase activity which is a main way to ensure immortalization. Anchorage-independent growth, a hallmark of transformation, was not detected. In addition, the senescence control genes p53, p16 and p21 did not show obvious mutations. Together with the observation that regrowing fibroblasts underwent replicative senescence, these results indicate that regrowing fibroblasts were neither immortalized nor transformed. PUVA-induced senescence features were reversible. Enlarged cell morphology, expression of senescence-associated (SA) -galactosidase and matrix-metalloprotease-1 were lost when fibroblasts resumed growth. Senescence control genes p53 and p21 were maintained for 1 month, whereas upregulation of p16 was maintained during the whole growth arrest. ROS levels were elevated increasingly after PUVA treatment with a maximum of 20-fold at six weeks post PUVA, which is both due to mitochondria and NADPH oxidase. Scavenging of ROS by the antioxidant N-acetyl cystein (NAC) prevented PUVA-treated fibroblasts from cytoplasmic enlargement but not from SA--galactosidase expression suggesting a role of ROS in the induction of phenotypical but not of functional senescent changes. Interestingly, PUVA-treated fibroblasts cultured in their regrowing state reach the stationary phase at a much lower cumulative population doubling than control fibroblasts. The reduced total life-span was due to oxidative stress induced telomere erosion as scavenging of ROS by NAC rescued cell from telomere erosion and partly restored the life-span. These data support the view that the preceding damage affects a counting mechanism contributing to the overall proliferation potential. The initiation of the growth arrest was studied, and the amount of interstrand cross-links was not correlative. To further study whether damaged cytoplasts or damaged nuclear DNA are responsible for the growth arrest, nuclei and cytoplasts of PUVA-treated fibroblasts were fused with control cytoplasts or nuclei to reconstruct hybrids with either undamaged cytoplasts or undamaged nuclei. Fused cells with PUVA-cytoplasts, although growth arrested, start to regrow earlier post-PUVA at about day 40. Fused cells with PUVA-karyoplasts did not adopt a flattened phenotype and die after 2 weeks. These data indicate that PUVA-induced changes in the cytoplasts contribute to growth arrest, but may not be exclusively, while the contribution of the nuclear damage after PUVA cannot be fully evaluated by these experiments. Collectively, these data suggest that PUVA-induced changes do not fully reflect replicative senescence but rather represent a long-term transient phenocopy. The model reported here is particularly suited to elucidating mechanisms underlying long-term senescence-like growth arrest and related functional changes.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Title	Language
Langzeit-Wachstumsarrest und Reproliferation humaner dermaler Fibroblasten nach Behandlung mit 8-MOP plus UVA für die Stress-induzierte frühzeitige Alterung und die replikative Seneszenz von zellen	German

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Abstract

Language

Replikative Seneszenz bezeichnet das irreversible Ende der Teilungsfähigkeit somatischer Zellen. In der Dermatologie werden hyperproliferative Hauterkrankungen mit der Kombination aus oraler Aufnahme des Photosensibilisators 8-Methoxypsoralen (P) und Ultraviolett-A (UVA) Bestrahlung als PUVA-Therapie behandelt. Humane dermale Fibroblasten reagierten auf PUVA mit Verlust der Teilungsfähigkeit und morphologischen und funktionalen Kennzeichen einer seneszenten Zelle. Im Gegensatz zur unumkehrbaren replikativen Seneszenz wurde nach drei Monaten eine Wiederaufnahme der Proliferation beobachtet. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Mechanismen des PUVA-induzierten Arrestes und der Wiederaufnahme des Wachstums im Vergleich zur replikativen Seneszenz als Folge erschöpfter Teilungsfähigkeit. Ein Zusammenhang zwischen direkten und indirekten DNA-Schäden nach Psoralen-Photoaktivierung und dem Wachstumsarrest konnte experimentell nicht gezeigt werden. Zellhybride aus Zytoplasten PUVA-behandelter und Karyoplasten unbehandelter Fibroblasten arretierten nach wenigen Tagen für ein bis zwei Monate. Diese Ergebnisse weisen auf die Bedeutung von Schäden des Zytoplasmas und der Membranen hin. Vergrößertes Zellvolumen, Expression von Matrixmetalloproteinase-1, SA-beta-Galaktosidase und von p16, p21 und p53 als Zeichen der replikativen Seneszenz waren innerhalb der Arrestphase, nach der Wiederaufnahme der Proliferation jedoch nicht mehr nachweisbar. Wachstumsarretierte Fibroblasten steigerten die Produktion reaktiver Sauerstoffintermediate in den Mitochondrien oder durch NADPH-Oxidasen bis auf das 20-fache. Nach Reproliferation zeigten die Fibroblasten eine "molekulare Narbe" in Form einer verminderten Lebensspanne. Ursächlich war die Sauerstoffradikal-abhängige Telomeren-Erosion. N-Acetylzystein schützte als Antioxidans vor den morphologischen Veränderungen und zumindest teilweise vor der Reduktion der Lebensspanne. Da reproliferierende Fibroblasten weder Adhäsions-unabhängig wuchsen noch de novo Telomeraseaktivität zeigten, wurden Immortalisierung und neoplastische Transformation als Ursachen der Reproliferation ausgeschlossen. Eine PUVA-"Therapie" von Fibroblasten führt zu einem deutlich von der replikationsabhängigen zellulären Seneszenz unterscheidbaren Alterungsphänotyp. Diese Phänokopie der replikativen Seneszenz scheint geeignet, die Ursachen und Mechanismen der zellulären Seneszenz im molekularen Detail zu untersuchen.

German

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