Universität zu Köln

Entwicklung und Validierung eines Bioassays zum Nachweis induzierter Genaktivität für den Einsatz auf der Internationalen Raumstation

Arenz, Andrea (2007) Entwicklung und Validierung eines Bioassays zum Nachweis induzierter Genaktivität für den Einsatz auf der Internationalen Raumstation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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                      Abstract

                      Neben der fehlenden Schwerkraft stellt die Strahlenbelastung des Astronauten einen limitierenden Faktor für den Langzeitaufenthalt des Menschen im Weltraum dar. Experimente zur Untersuchung einer möglichen Interaktion zwischen Mikrogravitation und der zellulären Strahlenantwort können auf der Erde nur unzureichend bearbeitet werden. Die Internationale Raumstation bietet als derzeit wichtigste Forschungsplattform eine Möglichkeit, dieser Fragestellung nachzugehen. Im Weltraumexperiment Cellpath soll eine geänderte Genexpression schadensrelevanter Gene unter Verwendung von indikativen Bioassays analysiert werden. Dazu sollte ein auf dem Rezeptor-Reporter-Prinzip basierendes, zelluläres Testsystem konzipiert werden. Um einen für diesen Zweck geeigneten Promotor- oder Enhancer zu finden, der die Rolle eines regulatorischen Elements übernimmt, wurde die Expression verschiedener Gene untersucht, deren Genprodukte in unterschiedlichen DNA-Reparaturwege involviert sind. Anhand einer in verschiedenen humanen Zelllinien (A549, MCF-7, AGS, HEK und NHF) durchgeführten strahlenbiologischen Charakterisierung wurden A549-Zellen als geeignete Wirtslinie für das Testsystem identifiziert. Die Ergebnisse der mittels quantitativer Real Time RT-PCR durchgeführten Genexpressionsstudien wiesen das p53R2 Gen als geeigneten Kandidaten für die Etablierung eines induzierbaren Bioassays aus. Für dessen Entwicklung wurde ein Vektorsystem konstruiert, das die Expression des Reportermoleküls EGFP unter der Kontrolle der p53-abhängigen Form der Ribonukleotid Reduktase (p53R2) als Sensor ermöglicht. Dazu wurde die Bindestelle für den Transkriptionsfaktor p53 aus dem 1. Intron des p53R2 Gens in den promotorlosen EGFP-Vektor kloniert und stabil in A549 Zellen transfiziert. Die Induzierbarkeit der rekombinanten Zelllinie A549-RRM2b wurde in biologischen Experimenten mit Strahlung unterschiedlicher Qualität überprüft. Die nach Exposition mit Röntgenstrahlen, beschleunigten Kohlenstoff- und Argon-Ionen erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass der rekombinanten Zelllinie eine hohe Bedeutsamkeit für ein Weltraumexperiment zukommt.

                      Item Type: Thesis (PhD thesis)
                      Translated abstract:
                      AbstractLanguage
                      Exposure of astronauts to space radiation, together with the reduced gravity level, represents the limiting factor for long-term human space missions. Experiments on the interaction of microgravity and radiation in mammalian cells can be performed only insufficiently on Earth. The International Space Station, as the most important space-based research platform, offers the possibility to perform relevant experiments. One of the first experiments to be flown on the European laboratory module COLUMBUS will be the experiment CERASP (and its successor experiment Cellpath). Aim of these experiments is to investigate the modulation of gene expression changes of damage-inducible genes under simultaneous exposure to microgravity and radiation. For that, a cellular test system, which is based on receptor-reporter-principles, was developed. It makes use of a host cell line and a stably integrated vector which controls EGFP expression as reporter protein by a DNA damage responsive element as a sensor. To identify a candidate gene promoter/enhancer, suitable to act as a regulatory element, gene expression studies of damage-inducible genes, whose products are operating in different DNA repair-pathways, were performed in a series of human cell lines using a quantitative real time RT-PCR based approach. The results of these studies showed the p53R2 gene to fulfil the requirements set for the establishment of such an inducible test system. The vector system was designed by inserting the p53 binding site located in the first intron of the gene coding for the inducible form of the Ribonucleotide Reductase (p53R2) in the MCS of the promoterless EGFP-1 vector. The radiation-biological characterisation of the examined cell lines (MCF-7, A549, AGS, NHF, and HEK) identified A549 cells as best suited for hosting the test system. After selection of EGFP expressing cell clones, the recombinant clone A549-RRM2b was chosen for further experiments based on its highly inducible reporter gene expression. This cell line was tested using different experimental treatment conditions. Exposure experiments with various radiation qualities (UV, X-rays, and accelerated carbon and argon ions) revealed the high suitability and significance of the cellular test system for future use in space experiments.English
                      Creators:
                      CreatorsEmail
                      Arenz, Andreaandrea.arenz@dlr.de
                      URN: urn:nbn:de:hbz:38-20332
                      Subjects: Life sciences
                      Uncontrolled Keywords:
                      KeywordsLanguage
                      Genaktivität, Reportergen, Weltraumstrahlung, DNA-Reparatur, MikrogravitationGerman
                      gene activity, space radiation, reportergen, DNA-repair, microgravityEnglish
                      Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
                      Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Zoologisches Institut
                      Language: German
                      Date: 2007
                      Date Type: Completion
                      Date of oral exam: 16 April 2007
                      Full Text Status: Public
                      Date Deposited: 27 Jun 2007 14:35:16
                      Referee
                      NameAcademic Title
                      Anton, Hermann JosefProf. Dr.
                      URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2033

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