Universität zu Köln

Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum Sphingosin-Stoffwechsel in vitro und in Mausmutanten

Hammels, Ina (2009) Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum Sphingosin-Stoffwechsel in vitro und in Mausmutanten. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Die Serin Palmitoyl-CoA-Tranferase (spt) stellt das Schüsselenzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Die von spt katalysierte Reaktion ist die Kondensation von Serin mit Palmitoyl-CoA unter Bildung von 3-Oxosphinganin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Konstrukt zur heterologen Expression von spt in HEK293 Zellen erstellt. Das Konstrukt wurde in der Arbeit zur näheren Charakterisierung der spt verwendet. Dafür wurden SPT-Aktivitätsmessungen an den HEK293 Zellen mit [U-14C]-Serin und [1-14C]-Palmitinsäure durchgeführt. Desweiteren wurden Veränderung des Lipidstoffwechsels untersucht. Dafür wurde ein in vivo-Assay mit [1-14C]-Palmitinsäure durchgeführt, durch den eine Zunahme des Glucocerebrosids beim spt-Klon im Vergleich zu den WT-Zellen festgestellt wurde. Veränderungen der Expression anderer Gene des Sphingolipidmetabolismus sind untersucht worden. Zusätzlich wurde nachgewiesen, daß eine Überexpression von spt keine Apoptose auslöst. Es wurde eine vergleichende Analyse des Katabolismus durch Verwendung der Enzyme Sphingosin-1-Phosphat Lyase und Sphingosinkinase durchgeführt. Zum besseren Verständnis der Bedeutung von spt, sollte eine induzierbare konditionelle spt defiziente Mausmutante generiert werden. Dafür wurde ein replacement Vektor homolog rekombiniert in embryonale Stammzellen eingebracht. Durch Vorkern-Injektion sollte zudem eine leberspezifisch Cre exprimierende Mauslinie generiert werden. Der verwendete Vektor entsprach dem �tet on� System, was eine Induktion von Cre nach Doxicyclin-Gabe ermöglichen sollte.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Serine palmitoyltransferase (spt) is the key enzyme of sphingolipid metabolism. Spt catalyses the condensation of serine with palmitoyl CoA to form 3-oxosphinganine, which is further transformed into shingosine containing ceramides In this study a vector construct was established for heterologous expression in HEK293 cells. The construct was used for the characterisation of SPT-activity. For quantification radioactive labeled [U-14C]-serine and [1-14C]-palmitic acid were used in HEK293 cells. Studies on sphingolipid metabolism were carried out in in vivo assay-systems with [1-14C]-palmitic acid. Changes in the expression of other genes from the sphingolipid metabolism have been tested. Importantly, no apoptosis could be detected in the clone overexpressing spt. A comparative analysis for the catabolic enzymes sphingosine-1-phosphate lyase and sphingosinkinase was made. For the generation of a conditional spt knock out mouse a replacement vector was constructed for homologous recombination in ES-cell. A transgenic mouseline, which directs cre-recombinase expression liverspecifically, was generated by pronuclear injection. This vector uses the �tet on� system, which is inducible by doxycycline.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Hammels, Inaihammels@uni-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-27502
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Sphingolipide, spt, sphk, splGerman
    sphingolipids, spt, sphk, splEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Laboratorium für Molekulare Neuroforschung
    Language: German
    Date: 2009
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 23 April 2009
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 02 Jul 2009 11:58:48
    Referee
    NameAcademic Title
    Stoffel, WilhelmProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2750

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