Identifizierung des orthologen Ergothionein-Transporters des Zebrafischs, Etablierung und Phänotypisierung des Knockout-Modells

Bach, Markus (2009) Identifizierung des orthologen Ergothionein-Transporters des Zebrafischs, Etablierung und Phänotypisierung des Knockout-Modells. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Ergothionein (ET) ist ein natürliches Antioxidans, das nur von Pilzen und einigen Mykobakterien synthetisiert werden kann. Aufgrund der permanenten Ladungen ist ET nicht in der Lage ohne die Hilfe eines Transporters eine intakte Biomembran nennenswert zu passieren. Dies ist die physiologische Aufgabe des Ergothionein-Transporters (ETT, Gensymbol SLC22A4). Genetische Varianten des ETT konnten mit chronischen Entzündungskrankheiten, wie Morbus Crohn oder ulzerativer Kolitis, assoziiert werden. Des Weiteren gibt es Anzeichen dafür, dass der Transporter bzw. ET bei der Entstehung von Typ I Diabetes sowie grauem Star (Katarakt) eine Rolle spielt. Die physiologische Bedeutung von ET ist noch unklar, jedoch deuten die chemischen Eigenschaften und die hohen Konzentrationen in bestimmten Geweben, die hohem oxidativem Stress ausgesetzt sind, auf einen antioxidativen Schutz hin. Da bisherige Untersuchungen zur Funktion von ET überwiegend in vitro durchgeführt wurden, war es Ziel dieser Arbeit ein Zebrafisch-Knockout-Modell für den ETT zu etablieren. Mittels Sequenzanalyse konnten im Zebrafisch drei Kandidaten für einen orthologen ETT gefunden werden, die aufgrund der Sequenzidentität nicht eindeutig den humanen Transportern (ETT bzw. CTT, Gensymbol SLC22A5) aus der SLC22-Familie zugeordnet werden konnten. Nach der Klonierung und funktionellen Charakterisierung konnte genau ein ETT-Ortholog im Zebrafisch identifiziert werden. Die Analyse der Expression zeigte deutliche Gemeinsamkeiten zum humanen ETT und die in vivo Aktivität eines ETTs konnte im Zebrafisch mittels LC-MS gemessen werden. Um den Effekt von ET auf den Organismus zu untersuchen, wurde eine Fischlinie etabliert, die den orthologen Ergothionein-Transporter aufgrund einer retroviralen Insertion im ersten Exon nicht mehr exprimiert. Diese ettzf-/--Fische (zf: zebrafish) sind nicht mehr in der Lage ET zu akkumulieren. Die Fische zeigen einen vollständigen ET-Mangel und ermöglichen erstmals Folgen dieses Mangels in vivo zu untersuchen. Die Phänotypisierung der Fische zeigte bisher unter normalen Laborbedingungen keine Mangelerscheinungen.

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