Universität zu Köln

Cellular maturation of mitochondrial molybdoenzymes

Klein, Julian (2012) Cellular maturation of mitochondrial molybdoenzymes. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    The molybdenum cofactor (Moco) is an essential component present in nearly all domains of life. In mammals, Moco is part of four currently known enzymes and constitutes a crucial redox-active center involved in a number of fundamental cellular reactions. Moco-dependent enzymes are present in the cytosol but also in or at mitochondria, where Moco is integrated into sulfite oxidase (SO) and the mitochondrial amidoxime-reducing component (mARC), respectively. The family of mitochondrial Moco-enzymes is of particular interest considering the cytosolic synthesis of enzymes and cofactor, which requires a coordinated mitochondrial transport and assembly process. In the current study, the mitochondrial maturations of SO and mARC1 were thus analyzed to obtain a mechanistic understanding of the processes starting with the cytosolic syntheses of apo-proteins all the way to the formation of the mature mitochondrial enzymes. The first part of this work uncovered the cellular assembly of SO, a soluble protein of the mitochondrial intermembrane space, and revealed a Moco-dependent mitochondrial targeting mechanism. In spite of its functional bipartite N-terminal targeting signal, about 70% of SO mislocalized to the cytosol if Moco was not present. Following the identification of SO processing by the inner membrane peptidase (IMP) complex, prevention of this cleavage and thus anchoring of SO in the inner mitochondrial membrane resulted in an efficient mitochondrial targeting even in absence of Moco. SO was thereby identified to undergo a reverse translocation to the cytosol in absence of Moco, which is required to trap SO in the intermembrane space and to constitute in addition a vectorial driving force for completion of SO translocation across the TOM complex. The integration of Moco is not only essential for correct sub-mitochondrial localization, but also a prerequisite for in vivo heme integration and homodimerization of SO. In conclusion, the identified molecular hierarchy of SO maturation represents a novel link between the canonical pre-sequence pathway and folding-trap mechanisms of mitochondrial import. The other mitochondrial Moco-enzyme mARC1 was recently discovered and its sub-mitochondrial localization had remained unclear. In the second part of this study, mARC1 was shown to be localized to the outer mitochondrial membrane. As a result of the translocation process, the C-terminal catalytic core of the protein remains exposed to the cytosol and confers an N(in)-C(out) membrane orientation of mARC1. This localization is mediated by the N-terminal domain of the enzyme, being composed of a classical but weak N-terminal targeting signal and a downstream transmembrane domain. Thereby, the transmembrane domain of mARC1 is sufficient for mitochondrial targeting, while the N-terminal targeting signal seems to function as a supportive receptor for the outer mitochondrial membrane. According to its localization and targeting mechanism, mARC1 is classified as a novel signal-anchored protein. Considering the membrane integration of mARC1, an SO-similar demand of Moco for mitochondrial retention of mARC1 is not required and its N-terminal targeting motifs are sufficient for adequate mitochondrial localization. During mitochondrial import, mARC1 is not processed and membrane integration proceeds membrane potential independently but requires external ATP, which finally results in the assembly of mARC1 into high-oligomeric protein complexes.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Der Molybdän-Cofaktor (Moco) ist ein essentieller Bestandteil in allen Organismenreichen. In Säugetieren bildet Moco ein wichtiges redox-aktives Zentrum von bisher vier bekannten Enzymen und ist dadurch an einer Vielzahl fundamentaler, zellulärer Reaktionen beteiligt. Moco-abhängige Enzyme liegen sowohl im Zytosol als auch in Mitochondrien vor, wobei Moco hier in die Sulfitoxidase (SO) und in die mitochondriale Amidoxim-reduzierende Komponente (mARC) eingebaut ist. Unter Berücksichtigung der zytosolischen Synthese von Moco, SO und mARC ist die Familie der mitochondrialen Moco-Enzyme dabei von besonderem Interesse, da diese einen koordinierten mitochondrialen Transport und einen entsprechend regulierten Reifungsprozess der beiden Enzyme verlangt. In dieser Arbeit wurden die mitochondrialen Reifungsprozesse von SO und mARC analysiert, um ein mechanistisches Verständnis dieser Prozesse zu erlangen. Im ersten Teil wurden dabei hierarchische Stufen zur zellulären Reifung der SO aufgedeckt. SO ist ein lösliches Protein des mitochondrialen Intermembranraums und zeigte dabei eine Moco-abhängige mitochondriale Lokalisierung. Ungeachtet der zweigeteilten N-terminalen mitochondrialen Zielsequenz wurden in Abwesenheit von Moco etwa 70% des Enzyms im Zytosol detektiert. Nachdem die Innere-Membran-Peptidase (IMP) als SO-prozessierende Protease identifiziert wurde, konnte eine über Mutationen verhinderte Prozessierung und damit eine Verankerung der SO in der inneren Membran eine vollständige mitochondriale Lokalisation auch in Abwesenheit von Moco erreichen. Dieses Experiment belegte, dass die SO einer reversen Translokation in Richtung Zytosol unterliegt, wenn Moco nicht eingebaut werden kann. Moco ist dabei für die Initiierung der SO-Faltung verantwortlich und verhindert dadurch zum einen den Rücktransport ins Zytoplasma und greift dadurch zum anderen auch aktiv in die Translokation der SO ein, indem die Faltung eine zusätzliche vektoriell getriebene Kraft für die vollständige Translokation in den Intermembranraum darstellt. Der Einbau des Moco ist nicht nur für die Lokalisation der SO essentiell, sondern auch eine Voraussetzung für den Einbau des Häm-Cofaktors und die Homodimerisierung der SO. Insgesamt stellt die dargestellte molekulare Hierarchie der SO-Reifung eine neue Verbindung zwischen dem kanonischen Prä-Sequenz Importweg und faltungsabhängigen Importmechanismen dar. Das mitochondriale Moco-Enzym mARC1 wurde erst kürzlich entdeckt, wobei seine sub-mitochondriale Lokalisation unklar blieb. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte nun die Assoziation von mARC1 mit der mitochondrialen Außenmembran demonstriert werden. Als Resultat des Translokationsprozesses bleibt die C-terminale katalytische Domäne dem Zytosol exponiert und verleiht mARC1 eine N(innen)-C(außen) Membrankonformation. Diese Lokalisation wird über die N-terminale Domäne des Enzyms gesteuert, welche aus einem klassischen aber schwachen N-terminalen Ziel-Signal und einer folgenden Transmembrandomäne besteht. Die Transmembrandomäne ist dabei hinreichend für die Lokalisation, wobei das Ziel-Signal als unterstützender Rezeptor für die mitochondriale Außenmembran zu dienen scheint. Sowohl die Lokalisation als auch der Transportmechanismus klassifizieren mARC1 dabei als ein neues Signal-verankertes Protein. Aufgrund der Membranverankerung von mARC1 ist der Einbau des Moco kein essentieller Bestandteil des Translokationsprozesses, welcher ausschließlich von den beiden N-terminalen Motiven gesteuert wird. Während des Importprozesses wird mARC1 nicht prozessiert und der Membraneinbau erfolgt unabhängig vom Membranpotential, erfordert jedoch die externe Zufuhr von ATP. Dies führt final zur Integration von mARC1 in hoch-oligomere Proteinkomplexe in der Außenmembran.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Klein, JulianJulian_Klein@gmx.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-49440
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    MitochondriaUNSPECIFIED
    Molybdenum cofactor (Moco)UNSPECIFIED
    Sulfite oxidaseUNSPECIFIED
    Mitochondrial amidoxime reducing component (mARC)UNSPECIFIED
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Biochemie
    Language: English
    Date: 2012
    Date Type: Publication
    Date of oral exam: 06 November 2012
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 11 Dec 2012 16:39:54
    Referee
    NameAcademic Title
    Schwarz, GünterProf. Dr.
    Langer , ThomasProf. Dr.
    Meisinger, ChrisProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4944

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