Kauppila, Timo Eino Sakari ORCID: 0000-0003-1668-6003 (2017). Mitochondrial DNA Mutagenesis in Metazoa: From Phenotypes to Rescue. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

All metazoans possess subcellular organelles of α-proteobacterial origin called mitochondria. These organelles participate in various cellular functions including cellular respiration, apoptosis, cell signaling and fatty acid oxidation. Although most mitochondrial proteins are encoded by the nuclear DNA and imported into mitochondria post-translationally, mitochondria still retain a small circular double-stranded multicopy genome (mtDNA) which encodes 13 essential proteins of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS) in addition to the transfer RNAs (tRNAs) and ribosomal RNAs (rRNAs) needed to translate the mtDNA-encoded messenger RNAs (mRNAs) within mitochondria. Therefore, faithful maintenance of mtDNA is essential for mitochondrial function and organismal viability. Mitochondrial dysfunction has been linked to ageing and ageing-associated diseases in various organisms. One group of dysfunctions is caused by mtDNA mutations, which are thought to originate from random replication errors of the mitochondrial DNA polymerase (POLγ). The amount of mtDNA mutations increases with age in humans and experimentally increasing mtDNA mutation load in mice results in a progeria phenotype. However, it is still unclear whether mtDNA mutations are limiting the lifespans of short-lived organisms such as fruit flies. To answer this question we first characterized POLγ variants with modified proofreading or polymerase activities in vitro. These variants were thereafter introduced into fruit flies using genetic engineering. Surprisingly, increasing mtDNA mutation load had no effect on fly physiology or ageing due to the slow accumulation of mtDNA mutations within the short lifespan of fruit flies and even across generations. These results suggest that mtDNA mutations are not limiting the lifespan of wild type fruit fly populations. Due to the multicopy nature of mtDNA, mutations can be present in only some of the molecules (heteroplasmy) or all of the molecules (homoplasmy) in a cell or tissue. It has been reported that pathogenic mtDNA mutations only cause mitochondrial dysfunction if they are present above a certain threshold level that depend on the type of mutation and the energetic requirement of the affected tissue. The heteroplasmy level is defined as the percentage of all molecules carrying the mutation. However, it has been also argued that the heteroplasmy level is, to some extent, irrelevant and that it is the absolute number of WT mtDNA copies that determines disease penetrance. To test this theory we took advantage of the mtDNA mutator mouse model, which carries proofreading-deficient POLγ and presents with male sterility. Overexpressing mitochondrial transcription factor A (TFAM), a well-characterized regulator of mtDNA copy number, was sufficient to partially rescue mitochondrial dysfunction and to cure the male infertility of this mouse model without affecting the mtDNA mutation load. These results provide the first experimental evidence that the absolute number of WT mtDNA molecules determines disease penetrance and offers a strategy to rescue mitochondrial dysfunction originating from mtDNA mutations.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:
AbstractLanguage
Alle Metazoen besitzen Mitochondrien, subzelluläre Organellen α-proteobaketeriellen Ursprungs, welche eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie zum Beispiel Zellatmung, Apoptose, Signalkaskaden und Fettsäureoxidation regulieren. Die meisten mitochondrialen Proteine sind zellkernkodiert und werden posttranslational importiert. Mitochondrien besitzen auch ein eigenes zirkuläres und doppelsträngiges Multikopie-Genom (mtDNA), welches für 13 essentielle Proteine der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS), sowie mitochondrienspezifische Transfer RNAs (tRNAs) und ribosomale RNAs (rRNAs) kodiert, welche zur Translation der OXPHOS-Proteine benötigt werden. Aufgrund dessen ist die Aufrechterhaltung und Regulation der mtDNA essentiell für die Funktion der Mitochondrien und damit auch der Lebensfähigkeit der Zelle. Mitochondriale Dysfunktion kann in verschiedenen Organismen Alterungsprozesse beschleunigen und zur Entstehung von alterungsassoziierten Krankheiten beitragen. Eine Klasse dieser mitochondrialen Krankheiten wird durch zufällig auftretende Replikationsfehler der mitochondrialen DNA polymerase (POLγ) induziert. Mutationen in der mitochondrialen DNA korrelieren positiv mit steigendem Alter im Menschen und ein vielfach erhöhter mtDNA-Mutationslevel in Säugetieren, wie der Hausmaus, führt zur Entstehung eines einen Progerie-Phänotyps. Einige Aspekte der zugrundeliegenden molekularen Ursachen sind jedoch unerforscht, so ist zum Beispiel nicht bekannt ob somatische mtDNA Mutationen die Lebensdauer von kurzlebigen Organismen, wie der Fruchtfliege, direkt beeinflussen. Zur Beantwortung dieser Frage wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit zunächst POLγ Varianten mit gesteigerter oder reduzierter Korrektur- bzw. Polymeraseaktivität in vitro charakterisiert. Um die Funktion dieser POLγ Varianten in vivo zu untersuchen wurden diese mittels gentechnischer Methoden in das Genom der Fruchtfliege integriert. Die transgenen Fruchtfliegen mit erhöhtem mtDNA Mutationslevel waren weder physiologisch noch hinsichtlich ihrer der Lebenserwartung negativ beeinflusst. Auch die Kreuzverpaarung mehrerer Fruchtfliegen-Filialgenerationen induzierte keinen vorzeitigen Alterungsphänotyp. Dies basiert auf der relativ langsamen Akkumulation von mtDNA Mutationen innerhalb des kurzen Lebenszyklus der Fruchtfliege. Diese Ergebnisse zeigen, dass mtDNA Mutationen wahrscheinlich nicht die Lebenserwartung von Wildtyp-Fruchtfliegenpopulationen beeinflussen. Aufgrund der Multikopien Natur der mtDNA können Mutationen in einigen wenigen mtDNA Molekülen der Zelle präsent sein (Heteroplasmie) oder in allen (Homoplasmie), wobei der Heteroplasmiegrad als der prozentuale Anteil an mtDNA Molekülen mit Mutationen definiert ist. Es ist bekannt, dass mtDNA Mutationen hohe Heteroplasmiegrade erreichen müssen um mitochondriale Dysfunktion auszulösen und um phänotypisch in Erscheinung zu treten. Es stellt sich jedoch weiterhin die Frage, ob der relative Heteroplasmiegrad oder die absolute Anzahl von Wildtyp-mtDNA Kopien in der gesamten Zelle für die phänotypische Erscheinung von mitochondrialen Krankheiten verursacht. Um diese Hypothese zu untersuchen wurde die sogenannte mtDNA-Mutator Maus, welche eine korrekturdefiziente POLγ Variante exprimiert und durch männliche Infertilität charakterisiert ist, mit einer Maus verpaart welche den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM) überexperimiert. Interessanterweise, konnte der Grad der mitochondrialen Dysfunktion und die Infertilität männlicher mtDNA-Mutator Mäuse, ausgelöst durch mtDNA Mutationen, partiell durch die Überexpression von TFAM reduziert werden. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass die absolute Anzahl an Wildtyp-mtDNA Molekülen entscheidend für die phänotypische Ausprägung von mitochondrialen Krankheiten ist und ermöglicht die Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von mtDNA Mutationen-basierter Krankheiten.German
Creators:
CreatorsEmailORCID
Kauppila, Timo Eino Sakaritimo.kauppila@age.mpg.deorcid.org/0000-0003-1668-6003
URN: urn:nbn:de:hbz:38-83425
Subjects: Natural sciences and mathematics
Life sciences
Uncontrolled Keywords:
KeywordsLanguage
Mitochondria, Mitochondrial DNA, mtDNA, Mutation, DNA polymerase gamma, Mitochondrial DNA polymerase, proofreading, fruit fly, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Mitochondrial transcription factor A, TFAMEnglish
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Language: English
Date: November 2017
Date of oral exam: January 2018
Referee:
NameAcademic Title
Larsson, Nils-GöranProf. Dr.
Uhlirova, MirkaProf. Dr.
Funders: Finnish Cultural Foundation
Refereed: Yes
URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8342

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