Universität zu Köln

Halbach, Arndt (2003). Proteinbiochemische Charakterisierung von PACSIN1 und seines Bindungspartners PAST2. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit konnten die zwei Teilkomponenten PACSIN1 und PAST2 intrazellulärer Transportsyteme nach deren Klonierung, eukaryontischer Expression und Aufreinigung näher charakterisiert werden. Mit Hilfe der gegen PAST2 generierten polyklonalen Antikörper wurde die über Two-Hybrid Untersuchungen festgestellte Interaktion der Bindungspartner durch Affinitäzspräzipitationen bestätigt Die durch diese Experimente zusätzlich festgestellte Interaktion mit Proteinen verschiedener intrazellulärer Transportwege legt eine Beteiligung des PAST2 Proteins an mehreren, unabhängigen intrazellulären Transportwegen nahe. In diesem Zusammenhang wurde eine breite Gewebeverteilung mit Hilfe der gegen PAST2 generierten Antikörper festgestellt. Zusätzlich konnte die durch Sequenzhomologien vermutete Funktion des PAST2 Proteins als G/ATPase durch entsprechende Experimente mit dem gereinigten Protein bestätigt werden. Vom Adapterprotein PACSIN1 war durch Two-Hybrid Untersuchungen und Experimente mit dem bakteriellen GST-Fusionsprotein eine Oligomerisierung bekannt. Mit dem eukaryontisch expremierten und gereinigtem Protein konnte hier durch verschiedene Techniken ein stabiles Tetramer nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde nach Periodatoxidation ein Aldehyd auf dem Phosphoprotein identifiziert werden, was auf eine Glykolysierung des Proteins schließen lässt.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Proteinbiochemical characterisation of PACSIN1 and his binding-partner PAST2 English
Translated abstract:	Abstract Language The focus of this work was the characterization of the PACSIN1 and PAST2 proteins after their cloning, eucaryotic expression and purification. The proteins are known to participite in intracellulary transport-systems. Polyclonal antibodies against the PAST2 protein were generated and used to confirm the PACSIN1 / PAST2 interaction, that had been earlier detected in two hybrid assays and by affinity precipitation. In pull-down assays additional binding partners, involved in different intracellular transport pathways were identified. A broad tissue distribution for PAST2 was shown by immunochemical methods. Additionally, A/GTPase activity could be predicted from the sequence and was confirmed by using recombinantly expressed and purified protein in A/GTPase assays. An oligomerisation of the PACSIN1 adapter protein had been detected in two-hybrid screens and in assays using the GST-PACSIN1 expressed in bacteria. This homo-oligomerisation was know characterised using the PACSIN1 expressed in mammalian cells. By severall different methods the protein was shown to form stable tetramers in solution. Additionally, it was possible to verify the presence of aldehyd groups on the protein after periodate-oxidation, indicating glycosylation of PACSIN1. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Halbach, Arndt arndt.halbach@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-10929
Date:	2003
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut II für Biochemie
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Proteininteraktion, Protein, Crosslinkink, Quervernetzung, eukaryontische, Expression, Adapterprotein, PACSIN, PAST, Gelfiltration, EBNA, HEK 293 German Proteininteraction, PACSIN, PAST, Crosslinking, Gelfiltration, Pull-Down, English
Date of oral exam:	12 January 2004
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Matz Prof Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1092