Analysis of the function of the CONSTANS protein and transcriptional regulation of FLOWERING LOCUS T

Wenkel, Stephan (2006). Analysis of the function of the CONSTANS protein and transcriptional regulation of FLOWERING LOCUS T. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The transition to flowering is one of the most important development switches in the life of a plant. For some species this switch appears only once in life and is therefore tightly regulated. Flowering is directly coupled to reproductive success and therefore has to occur under optimal conditions. Several genetic pathways regulate the transition to flowering. CO is a central component of the photoperiod pathway and mediates flowering in response to day length by regulating the expression of FT. CO encodes a B-Box transcription factor that also contains a plant specific CCT-domain. Since CO does not contain a known DNA-binding motif I conducted yeast-two-hybrid screening to identify proteins that recruit CO to DNA. In addition, I conducted yeast-one-hybrid screening to identify proteins regulating FT expression. Here I present evidence that CO interacts with all members of the heterotrimeric CCAAT-box-binding factor (CBF). The CBF-complex consists of three subunits named HAP2, HAP3 and HAP5. HAP3 and HAP5 dimerize and associate with the DNA-binding subunit HAP2. Both CCT-domain and HAP2 proteins contain the HAP2-DNA-binding motif. Mutations affecting conserved residues in this domain cause loss-of-function phenotypes in CCT-domain proteins, which might be due to an impaired interaction with HAP2. The HAP3a subunit is co-regulated with CO by GIGANTEA and expression of a putative dominant negative transgene causes late flowering. MtN19 was found to interact with the CCT-domain of CO and with the FT promoter in yeast. Studies on this gene suggest a possible regulation by natural antisense transcription since transgenic plants expressing a dsRNAi construct are late or early flowering. The early flowering lines express MtN19, CO and FT at high levels. Late flowering plants can not be rescued by overexpression of CO by the 35S-promoter. MtN19 and CO are both expressed at the end of the light period in long days implying that they might function together to regulate FT expression. FIDGET (FIT) was isolated by yeast-one-hybrid screening and found to bind the FT promoter. It encodes an APETALA2-like protein. Misexpression of FIT in the phloem, the place where FT is naturally expressed, accelerates the floral transition. Moreover, I present evidence that FIT is expressed in vascular tissue upon UV-light induction. Finally, I show that UV-light is able to accelerate the floral transition. Two other AP2-like proteins delay the floral transition when expressed in the phloem and can also interact with the FT promoter. In a nutshell, this thesis presents the first insight how CO may regulate expression of the floral integrator FT and proposes evidence for a novel flowering time pathway involving stress-induced AP2-like transcription factors.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Title	Language
Funktionelle Analyse des CONSTANS Protein und transkriptionelle Regulation von FLOWERING LOCUS T	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Die Entscheidung zur Ausbildung der Blüte ist einer der wichtigsten Prozesse in Pflanzen. Viele Pflanzen blühen nur einmal während ihres Lebens weshalb dieser Prozess einer strengen Kontrolle unterliegt. Da das Ausbilden der Blüte mit dem reproduktiven Erfolg des Organismus gekoppelt ist muss dieser Entwicklungsschritt unter optimalen Bedingungen erfolgen. Vier verschiedene genetische Signalwege, die in die Regulation der Blütenbildung involviert sind wurden bisher beschrieben. Einer der wichtigsten Signalwege, der die Ausbildung von Blüten und somit den Wechsel von vegetativem zu reproduktivem Wachstum einleitet ist der photoperiodische Signalweg. Licht bewirkt das Einstellen der inneren cirkadianen Uhr welche die zyklische Expression des CONSTANS (CO) Gens bewirkt. Die Stabilität des CONSTANS Protein wird durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen reguliert. Arabidopsis thaliana ist eine fakultative Langtagpflanze, was bedeutet dass sie in Lagtagbedingungen schneller zur Blüte kommt. CO bewirkt die florale Transition in Erwiderung auf eine lange Photoperiode durch Aktivierung von FLOWERING LOCUS T (FT). CO ist ein B-Box Transkriptionsfaktor mit einer pflanzenspezifischen, carboxyterminalen CCT-domäne. Da CO keine bekannte DNA-Bindedomäne besitzt haben wir Yeast-two-Hybridscreens durchgeführt um Proteine zu isolieren mit welchen CO an DNA binden kann. Darüber hinaus haben wir Yeast-one-Hybridscreens durchgeführt um Proteine zu finden welche mit dem FT-Promoter interagieren und dessen Aktivität beeinflussen können. Kapitel 4 dieser Arbeit zeigt, dass CONSTANS mit dem trimeren CCAAT-box-Bindefaktor (HAP-Komplex) interagiert. Der HAP-Komplex besteht aus drei Untereinheiten von denen zwei (HAP3 und HAP5) dimerisieren. Nach Bildung des HAP3/5 Dimers bindet die HAP2-Untereinheit welche eine DNA-Bindungsdomäne besitzt. Der ternäre Komplex kann sodann an DNA binden. CONSTANS interagiert mit allen Untereinheiten des HAP-Komplexes. Des Weiteren besitzt CONSTANS eine Domäne die der DNA-Bindedomäne von HAP2 ähnelt. Mutationen die hoch konservierte Aminosäuren in dieser Region in CCT- Domänen Proteinen betreffen haben Loss-of-function Mutationen zur Folge. Außerdem zeigen wir, dass HAP3a mit CO durch GIGANTEA (GI) ko-reguliert wird. Überexpression von FLAG:HAP3a, welches möglicherweise dominant-negativ agiert, hat einen spätblühenden Phänotyp zur Folge. Die verspäte Blütenbildung wird durch massive Repression von FT bewirkt. Kapitel 5 beschreibt MtN19, ein Protein unbekannter Funktion welches mit CONSTANS interagiert und welches außerdem an den FT Promoter binden kann. Studien des MtN19 Gens deuten darauf hin dass es eventuell über natürliche antisense-RNA reguliert wird. Transgene MtN19-dsRNAi Pflanzen zeigen zwei extreme Phänotypen, frühe oder späte Blütenbildung. Die früh blühenden Linien zeigen erhöhte Expressionslevel der MtN19 mRNA sowie der mRNAs von CO und FT, welche das vorzeitige Blühen erklären. Spätblühende Linien können auch durch Überexpression von CO nicht komplementiert werden. MtN19 und CO sind beide am Ende der Photoperiode des Langtages exprimiert und könnten so gemeinsam die Expression von FT kontrollieren. Kapitel 6 dieser Arbeit berichtet von der Isolierung von FIDGET (FIT). FIT codiert für einen APETALA2 (AP2) -like Transkriptionsfaktor und wurde durch Yeast-one-Hybridscreens als FT-Promoter-Bindeprotein isoliert. Expression von FIT im Phloem, dem Ort wo FT natürlicherweise exprimiert ist resultiert in früh blühenden Pflanzen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass FIT durch UV-Licht im Phloem induziert wird und dass UV-Licht die florale Transition beschleunigen kann. In einem Large-scale Experiment in welchem 1.000 Arabidopsis Transkriptionsfaktoren ektopisch im Phloem exprimiert wurden, resultierte in der Isolierung von verschiedenen AP2-Transkriptionsfaktoren welche den Blütezeitpunkt beeinflussen. Zwei dieser AP2-Transkriptionsfaktoren bewirken eine Verzögerung des Blühzeitpunktes und es konnte gezeigt werden dass diese beiden Proteine auch an den FT-Promoter binden können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der FT-Promoter als regulatorische Schaltstelle für aktivierende und reprimierende AP2-Transkriptionsfaktoren fungiert.

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