Universität zu Köln

Technau, Martin (2007). Die Transkriptions-Regulation des EGFR-Zielgens pipe und Analyse der KASH- und der SUN-Domänen-Proteine in der Oogenese von Drosophila melanogaster. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Diese Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Der erste Teil befasst sich mit der Transkriptionsregulation des Gens pipe, dessen spezifische Expression in ventralen Follikelzellen der Eikammer für die Bildung der dorsoventralen Achse des Drosophila-Embryos entscheidend ist. Die Repression der pipe Expression in dorsalen Follikelzellen hängt von der Aktivierung des EGF-Rezeptors durch den, in der Oocyte asymmetrisch lokalisierten, TGF-alpha-artigen Liganden Gurken ab. Der Einfluss verschiedener Kandidaten der pipe Transkriptionsregulation wurde von uns mittels klonaler Analyse getestet. Dabei zeigte sich, dass alle EGFR-regulierten Transkriptionsfaktoren, für die eine mögliche Rolle bei der Kontrolle der pipe Expression vermutet worden ist, nicht für die EGFR-Signal vermittelte, dorsale Repression von pipe verantwortlich sind. Parallel zu diesen Experimenten wurde die cis-regulatorische Region von pipe außerdem mit Hilfe bioinformatischer Methoden, basierend auf der evolutionären Konservierung funktionaler Elemente (phylogenetic footprinting), sowie durch die Analyse einer Reihe von Promotor-Reporter-Konstrukten untersucht. Dadurch konnten wir ein cis-regulatorisches Element von 31bp identifizieren, welches für die dorsale Repression von pipe eine essentielle Rolle spielt. In Gelretardationsexperimenten konnten wir in vitro eine spezifische Bindung von Proteinen aus Extrakten von Ovarien an dieses Element nachweisen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse der KASH (Klarsicht/Anc-1/Syne Homologie)- und SUN (Sad1/UNC-84)-Domänen-Proteine in Drosophila. KASH-Domänen-Proteine anderer Organismen lokalisieren an der äußeren Kernmembran und spielen unter anderem eine Rolle bei der Verknüpfung des Zellkerns mit Cytoskelett-Elementen; wir waren daher insbesondere an einer möglichen Funktion dieser Proteine bei der Kernpositionierung in der Oogenese interessiert. In C elegans und in Vertebraten hängt die Membran-Lokalisation der KASH-Proteine von einer direkten Interaktion mit den SUN-Proteinen ab, die in der inneren Kernmembran lokalisiert sind. In Drosophila findet man zwei KASH-Proteine, Msp-300 und Klarsicht (Klar), sowie zwei SUN-Proteine CG18584/CG3287 (auch Klaroid, Koi) und CG6589, von denen CG6589 jedoch nur in Männchen exprimiert wird. Bisher ist nur Klar intensiv untersucht worden, welches unter anderem eine Rolle bei der Kernwanderung während der Augenentwicklung spielt. Wir haben Deletionen von Msp-300 und CG18584/CG3287 generiert. Die Gesamtdeletion von Msp-300 führt zu larvaler Letalität, Teildeletionen deuten darauf hin, dass Msp-300-Protein-Isoformen ohne eine KASH-Domäne in Drosophila eine essentielle Funktion haben. Msp-300 und Klar werden während der Oogenese exprimiert und lokalisieren in den Nährzellen und der Oocyte an der Kernhülle. Der gleichzeitige Funktionsverlust beider KASH- Proteine hat jedoch keine Auswirkungen auf die Oogenese. Damit konnten wir eine frühere Veröffentlichung widerlegen, die eine Funktion von Msp-300 bei der Positionierung der Nährzellkerne aufzeigt. Die Deletion des SUN-Homologs CG18584/CG3287 führt zu einem Verlust der Kernmembran-Lokalisation beider KASH-Proteine. Die Funktion der SUN-Proteine bei der Lokalisation der KASH-Proteine ist somit auch in Drosophila konserviert. Die Deletion des SUN-Domänen-Homologs ist semilethal und homozygote Fliegen zeigen einen klar-identischen Augenphänotyp, die Oogenese ist in homozygoten Weibchen jedoch nicht betroffen. Auch CG18584/CG3287 hat somit keine essentielle Funktion in der Oogenese.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language The transcriptional regulation of the EGFR target gene pipe and analysis of the KASH and the SUN domain proteins in oogenesis of Drosophila melanogaster English
Translated abstract:	Abstract Language This thesis is subdivided into two parts. The first part deals with the transcriptional regulation of the gene pipe, whose specific expression in the ventral follicle cells of the egg chamber is crucial for the establishment of the dorsoventral axis of the Drosophila embryo. The repression of pipe in dorsal follicle cells depends on the activation of the EGF receptor (EGFR) in these cells by the TGF-alpha like ligand Gurken, which is localised asymmetrically inside the oocyte. We have tested the influence of several candidates for the transcriptional regulation of pipe via clonal analysis. By these means, we have been able to show that all EGFR regulated transcription factors which have been assumed to play a role in the control of pipe expression, are not involved in the EGFR mediated dorsal repression of pipe. Parallel to these experiments we have analysed the cis-regulatory region of pipe by using bioinformatical methods, based on the evolutionary conservation of functional elements (phylogenetic footprinting), and additionally by the analysis of several promoter reporter constructs. This approach led to the identification of a 31 bp cis-regulatory element which plays a crucial role in the dorsal repression of pipe. In a band shift assay we could demonstrate that proteins from ovarian extracts bind specifically to this element. The second part of the thesis deals with the analysis of the KASH (Klarsicht/Anc-1/Syne Homologie) and SUN (Sad1/UNC-84) domain proteins in Drosophila. KASH domain proteins of other organisms localise to the outer nuclear membrane and play a role among others in the connection of the nucleus with cytoskeletal elements. Thus, we were especially interested in a possible function of these proteins in nuclear positioning during oogenesis. In C elegans and vertebrates the membrane localisation of the KASH proteins depends on a direct interaction with the SUN proteins, which localise at the inner nuclear membrane. In Drosophila two KASH proteins - Msp-300 and Klarsicht (Klar) - have been identified, as well as two SUN proteins, namely CG18584/CG3287 (synonym Klaroid, Koi) and CG6589, of which CG6589 is only expressed in males. So far only Klar has been intensively investigated, which plays a role among others in nuclear migration during eye development. We generated deletions of Msp-300 and CG18584/CG3287. The complete deletion of Msp-300 leads to larval lethality, partial deletions indicate that Msp-300 isoforms without a KASH domain have an essential function in Drosophila. Both Msp-300 and Klar are expressed during oogenesis and localise in the nurse cells and the oocyte at the nuclear envelope. However the concomitant loss-of-function of both KASH-proteins has no effect on oogenesis. Thus we could disprove an earlier publication which described a function for Msp-300 in the positioning of the nurse cell nuclei. The deletion of the SUN homolog CG18584/CG3287 leads to the loss of the correct localisation of both KASH proteins at the nuclear membrane. Hence the requirement of the SUN proteins for the localisation of the KASH proteins is conserved in Drosophila. The deletion of the SUN domain homolog is semilethal and homozygous flies show an eye phenotype identical to klar, however oogenesis is not affected in homozygous females. Thus also CG18584/CG3287 has no essential function in oogenesis. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Technau, Martin martin.technau@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-22925
Date:	2007
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institut für Entwicklungsbiologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language pipe , Drosophila melanogaster, Oogenese, Msp-300, KASH-Domänen-Proteine German pipe , Drosophila melanogaster, oogenesis, Msp-300, KASH-domain-proteins English
Date of oral exam:	14 February 2008
Referee:	Name Academic Title Roth, Siegfried Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2292