Inhibition of HBV replication by RIG-I stimulation with 5`-triphosphated siRNA in vitro and in vivo

Ebert, Gregor (2009). Inhibition of HBV replication by RIG-I stimulation with 5`-triphosphated siRNA in vitro and in vivo. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

For a proportion of patients, HBV infection results in chronic disease with severe consequences like liver cirrhosis or hepatocellular carcinoma. Approved therapies of chronic hepatitis B include administration of antivirally active IFN-alpha and inhibitors of viral reverse transcription. These drugs control replication, but HBV cccDNA, the episomal transcription template, persists in most cases. Hence, lifelong therapy is required, accompanied by severe side effects and development of drug resistant mutants. An alternative and probably safe immunotherapeutic approach for clearance of HBV may be achieved by the stimulation of pattern-recognition receptors inducing an endogenous type-I IFN response. In this study the cytosolic helicase RIG-I was triggered by in vitro transcribed 5�-triphosphated (3p-) dsRNA. Stimulation induced an RIG-dependent antiviral type-I IFN response and controlled HBV replication in vitro in stable HBV replicating cell lines as well as in HBV infected primary human hepatocytes. In vivo, virus replication in HBV transgenic animals was transiently controlled when Rig I ligands were complexed and i.v. injected. To enhance and prolong the antiviral effect, siRNAs targeting overlapping open reading frames of the HBV genome at the 3´-end of multiple HBV-RNAs were designed and investigated whether they can be in vitro transcribed and act as RIG-I ligands, and thus combine the immune stimulatory potential with HBV specific gene silencing. 3p-siRNAs were transfected into HBV replicating cells, induced INF-I and IFN-stimulated genes. HBV replication markers were significantly reduced and the antiviral effect of 3p-siRNA was superior to siRNA or 3p-RNA alone. Stronger effects of 3p-siRNAs on HBV replication were confirmed in HBV infected primary human hepatocytes, as well as in vivo. Nevertheless, the gene silencing effect of 3p-siRNA seemed to be limited in the mouse model due to insufficient targeting of hepatocytes, the HBV host cells. Application of cholesterol coupled siRNA improved hepatocyte specific targeting. Furthermore, we showed that 3p-siRNA besides a direct antiviral effect additionally induced infiltration of cytotoxic CD8+ T cells to the liver, potentially leading to elimination of infected hepatocytes. The results of this study demonstrate that HBV-specific 5`-triphosphated siRNAs efficiently block HBV replication in vitro and in vivo. Combination of endogenous type-I IFN induction by stimulation of RIG-I with HBV sequence-specific gene silencing by RNAi in one single molecule could be a promising alternative to the actual standard therapeutic approaches against chronic HBV infection.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

Language

Eine Infektion mit dem Hepatitis B Virus fuehrt bei einem Teil der Patienten zu einem chronischen Infektionsverlauf mit schwerwiegenden Spätfolgen, wie Leberzirrhose oder hepatozellulärem Karzinom. Die gängigen Therapien einer chronischen HBV Infektion umfassen IFN-alpha und Reverse Transkriptase Inhibitoren als Hemmstoff der viralen Replikation. Diese Medikamente kontrollieren die Virusreplikation. In den meisten Fällen ist es aber nicht möglich, die episomal persistierende virale Transkriptionsmatrize (HBV cccDNA) zu eliminieren. Dadurch wird eine lebenslange Therapie erforderlich, die von Nebenwirkungen und dem Entstehen von arzneimittelresistenten HBV-Mutationen begleitet sein kann. Die Stimulation von RIG-I, einer cytoplasmatischen Helikase, kann zu der Freisetzung von endogenem, antiviral wirksamen Typ 1 IFN fuehren und stellt somit einen neuen, therapeutischen Ansatz fuer eine Behandlung der chronischen Hepatitis B dar. Die Stimulation von RIG-I mittels durch in vitro Transkription generierte 5´-triphosphorylierte (3p), doppelsträngige RNA fuehrte in stabil HBV exprimierenden Zelllinien, in HBV infizierten primären humanen Hepathozyten und in HBV transgenen Mäusen zu einer Ausschuettung von Typ 1 IFN, und folglich zu einer Suppression der Virusreplikation. Um diesen antiviralen Effekt zu verstärken, wurden siRNAs entworfen, die die ueberlappenden offenen Leseraster des HBV Genoms am 3`-Ende aller viralen RNAs als Ziel haben. Es wurde untersucht, ob diese nach in vitro Transkription zur Stimulation von RIG-I fähig sind und es somit zu einer Kombination von Immunstimulation und Hemmung der viralen Genexpression kommt. Die ausgewählten 3p-siRNAs fuehrten in HBV replizierenden Zellen zur Induktion von Typ 1 IFN und IFN-stimulierter Gene. Sie kontrollierten die HBV Replikation sowohl in stabil HBV exprimierenden Zellen, in HBV infizierten primären Hepathozyten, als auch in HBV transgenen Mäusen effizienter als die alleinige Applikation von siRNA oder 3p-RNA. Im Mausmodel konnte außerdem durch die Kopplung von siRNA an Cholesterol ein verbessertes Targeting von Hepatozyten, den HBV-Wirtszellen, erreicht werden. Die Injektion von 3p-siRNAs fuehrte in vivo zu Einwanderung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen in die Leber, die zur Elimination der HBV infizierten Zellen beitragen können. Somit kann durch HBV-spezifische 3p-siRNA die HBV Replikation in vitro und in vivo effektiv unterdrueckt werden. Vereinigt in einer Substanz stellt die kombinierte Induktion von endogenem Typ 1 IFN und die spezifische Hemmung der viralen Genexpression eine vielversprechende Alternative zu den Therapien der chronischen HBV-Infektion dar.

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