Analysis of the arachidonyl-CoA synthetase ACSL4a as a potential regulator of BMP expression and of the role of BMPs in timing of cell commitment along the dorsoventral axis of the gastrulating zebrafish embryo

Renisch, Björn (2009). Analysis of the arachidonyl-CoA synthetase ACSL4a as a potential regulator of BMP expression and of the role of BMPs in timing of cell commitment along the dorsoventral axis of the gastrulating zebrafish embryo. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Signale durch Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) spielen im Zebrafish und Frosch Embryo eine entscheidende Rolle bei der Musterbildung entlang der dorsoventralen Achse, dabei bestimmen sie sowohl unterschiedliche Zellschicksale als auch die gerichtete Zellbewegung entlang der D/V-Achse während der Gastrulation. Mehrere soegannte "forward genetic" Screens mit ENU-mutagenisierten Zebrafischen haben die unentbehrliche Funktion von mehreren Komponenten des BMP-Signal-Wegs aufgezeigt, darunter die BMP-Liganden selbst, die Rezeptoren von BMPs, der durch BMPs regulierte Transkriptionsfaktor Smad5 und der extrazelluläre BMP-Inhibitor Chordin. Der BMP-Signalweg interagiert mit denen anderer Signalwege, wie Fibroblast Growth Factors oder Wnts. Jedoch gibt es immer noch neue Gene zu entdecken, die in Prozessen der frühen Musterbildung beteiligt sind; weiterhin ist die genaue Rolle des BMP Gradienten in der Festlegung von Zellschicksalen entlang der D-V Achse eines gastrulierenden Zebrafisch Embryos nicht vollkommen geklärt. Als Ausgangspunkt meiner Doktorarbeit habe ich an einem rückwärts gerichteten genetischen Screen, basierend auf Antisense Morpholino Oligonukleotiden für spezifischen Knock-Down von Genen im Zebrafisch, teilgenommen. Als Teil eines Konsortiums mehrerer Arbeitsgruppen habe ich eine Kollektion von Morpholinos erstellt und auf Phänotypen in der Frühentwicklung, Entwicklung der Hypophyse und der Haut untersucht. Ein Morpholino, gerichtet gegen das Gen acyl-CoA Synthetase longchain family member 4a (acsl4a), dessen Produkt im Metabolismus der langkettigen Fettsäure Arachidonsäure beteiligt ist, verursachte Defekte in der D-V Musterbildung. Im ersten Teil dieser Arbeit beschreibe ich den Phänotyp von Embryonen nach dem Knock-down von acsl4a, der auf eine essentielle Rolle von Acsl4a in der Aufrechterhaltung des Gradienten des BMP Signals während der Gastrulation hindeutet. Jedoch konnte der Phänotyp nur mit einem von mehreren untersuchten Morpholinos erreicht werden. Ebenfalls ist es mir missglückt die Defekte durch gleichzeitige Überexpression von acsl4a, welches nicht von dem Morpholino erkannt wird, zu retten. Ausserdem habe ich weitere Komponenten des Archidonsäure Metabolismus untersucht, jedoch keine der getesteten Komponenten interferierte mit der Frühentwicklung des Zebrafisch Embryos. Zusammengefasst bleibt die Rolle von acsl4a und seine Verbindung zum BMP-Signalweg während der D-V Musterbildung des Zebrafisch Embryos ungeklärt. Im zweiten Teil dieser Arbeit befasse ich mit der Frage der Festlegung von Zellschicksalen, genauer der zeitlichen Folge der zellulären Bestimmung, entlang der D-V Achse und ihrer Abhängigkeit von BMP Signalen. Entsprechen dem Konzept von Morphogenen bestimmt der stufenweise von dorsal nach ventral ansteigende BMP Gradient die verschiedenen Zellschicksale entlang der D-V Achse. Im Ektoderm wird angenommen, dass ein hoher Grad von BMP Signal epidermale Schicksale induziert, bei gleichzeitigem blockieren der neuralen Entwicklung, so dass ventrale Zellen zu Haut werden, während Neuronen sich aus dem dorsalen Ektoderm, wo der Grad der BMP Signale am niedrigsten ist, entstehen. In anderen Zusammenhängen wurden BMPs als Faktoren beschrieben die die Pluripotenz von Stammzellen aufrechterhalten, dabei arbeiten sie als prinzipieller Inhibitor von Zellspezifikationsprozessen. Interessanterweise ist der Gradient von BMPs sehr dynamisch über die Zeit, mit einer sehr breiten Expression zu einem frühen Zeitpunkt, die während der Gastrulation schrittweise auf die ventrale Seite des Embryos beschränkt wird. Deswegen habe ich mich gefragt, ob BMPs das ventrale Ektoderm in einem mehr pluripotenten Zustand halten, während dorsale Zellen zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt spezifiziert und auf ihr endgültiges Zellschicksal festgelegt werden, passend zu dem früheren Verlust der Expression von BMPs. Um diesen Gedanken zu überprüfen habe ich Studien zur zellulären Festlegung mit heterotopischen und heterochronischen Transplantationen von dorsalen gegen ventralen ektodermalen Zellen des Zebrafisch Embryos während verschiedener Zeitpunkte der Gastrulation durchgeführt. Überraschenderweise, konnte ich weder für ventrale noch dorsale Zellen zeigen, dass sie auf ihr ursprüngliches Schicksal festgelegt sind, da sie die Expression ihrer entsprechenden Markergene nach der Transplantation in eine ektopische Umgebung verlieren. Jedoch, nur ventrale Zellen waren fähig das Schicksal ihrer neuen Umgebung (dorsal) anzunehmen, wobei dorsalen Zellen in einer ektopischen ventralen Umgebung sowohl die Expression dorsaler als auch ventraler Markergene fehlt. Dies zeigt, dass ventrale ektodermale Zellen tatsächlich ihre Pluripotenz länger als dorsale Zellen behalten. Weitere Experimente mit mutanten Embryonen haben zu zeigen ob dieser Effekt Signale durch BMPs benötigt.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Analyse der Arachidonyl-CoA Synthetase ACSL4a als potentieller Regulator der Expression von BMPs und der Rolle von BMPs in der zeitlichen Festlegung von Zellschicksalen entlang der dorsoventralen Achse des gastrulierenden Zebrafisch Embryos	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Signaling by Bone Morphogenetic proteins (BMPs) plays a pivotal role during early dorsoventral (D-V) patterning of fish and frog embryos, determining both differential cell fates as well as the direction of cell movements along the D-V axis during gastrulation. Several forward genetics screens with ENU-mutagenised zebrafish have unravelled the indispensable function of several components of the BMP signaling pathway, including the BMP-ligands themselves, BMP receptors, the BMP-regulated transcription factor Smad5 and the extracellular BMP inhibitor Chordin. The BMP signaling pathway interacts with that of other signaling molecules, like Fibroblast Growth Factors or Wnts. However, there are still new genes to be discovered involved in early patterning processes; also the exact role of the BMP gradient in cell fate determination along the D-V axis of the gastrulating zebrafish embryo is not absolutely clarified. As starting point of my thesis work I participated in a reverse genetics screen based on antisense morpholino oligonucleotides for specific gene knock-downs in zebrafish. As part of a consortium of several labs, I designed and screened a collection of morpholinos for phenotypes in early patterning, pituitary development and skin development. A morpholino targeting the gene acyl-CoA Synthetase longchain family member 4a (acsl4a), whose product is involved in the metabolism of the longchain fatty acid arachidonic acid, caused defects in D-V patterning. In the first part of this thesis I characterise the phenotype of embryos after acsl4a knock-down, pointing to an essential role of Acsl4a in maintaining the BMP signaling gradient during gastrulation. However, the phenotype could only be obtained by one of several tested morpholinos. Also, I failed to rescue the defects by concomitant forced expression of acsl4a that is not targeted by the morpholino. Furthermore, I tested other components of the arachidonic acid metabolism, none of which interfered with early patterning of the zebrafish embryo. In conclusion, the role of acsl4a, and its connection to BMP signaling during D-V patterning of the zebrafish embryo remains elusive. In the second part of the thesis I address the question of cell fate commitment, thus the timing of cell determination, along the D-V axis and its dependence on BMP signaling. According to the morphogen concept, the BMP gradient with from dorsal-to-ventral progressively increasing BMP signaling determines differential cell fates along the D-V axis. In the ectoderm, high BMP levels are thought to induce epidermal fates, while blocking neural development, so that ventral cells will give rise to skin, whereas neurons are formed from the dorsal ectoderm, where BMP levels are lowest. In other instances, BMPs have been described as factors that maintain the pluripotency of stem cells, thus acting as a principle inhibitor of cell specification processes. Interestingly, the BMP gradient is highly dynamic over time, with a rather broad expression early, which becomes progressively restricted to the ventral side of the embryo during the course of gastrulation. Therefore, I wondered whether BMPs might keep the ventral ectoderm in a more pluripotent state, while dorsal cells become specified and committed to their final fate significantly earlier, consistent with the earlier loss of BMP expression. To test this notion, I carried out differential cell commitment studies by heterotopic and heterochronic transplantations of dorsal versus ventral ectodermal cells of the zebrafish embryo during different stages of gastrulation. Surprisingly, neither ventral nor dorsal cells were found to be committed to their initial fates, indicated by the loss of their respective marker genes expression upon transplantation into the ectopic environment. However, only ventral cells were able to adopt the fate of their new environment (dorsal), whereas dorsal cells in an ectopic ventral environment lacked both dorsal and ventral marker gene expression. This indicates that ventral ectodermal cells do indeed maintain their pluripotency longer than dorsal cells. Further experiments with mutant embryos have to show whether this effect requires BMP signaling.

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