Activity-based protein profiling in plants - Kölner UniversitätsPublikationsServer

Gu, Christian (2009). Activity-based protein profiling in plants. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Activity-based probes (ABPs) are reporter-tagged inhibitors that label enzymes in an activity-dependent manner. Using ABPs, activity-based protein profiling (ABPP) portrays active enzymes in complex proteomes. A collection of ABPs was screened and characterized for labeling of Arabidopsis leaf extracts and tomato leaf apoplastic fluids (AFs). We focused on four ABPs: epoxide probe DCG-04; fluorophosphonate probe FP; vinyl sulfone probe MV151; and β-lactone probe IS4. First, we optimized the labeling conditions and identified the labeling targets. Second, we performed comparative ABPP and detected proteins whose activities are differential during benzothiadiazole (BTH)-induced plant defenses and pathogen infections. Third, we performed competitive ABPP and identified targets of pathogen-derived and chemically-synthesized inhibitors. The major findings are as follows: (i) Using DCG-04, we labeled seven papain-like cysteine proteases (PLCPs) in tomato leaf AFs, and found that the activity of PLCP PIP1 is induced upon BTH treatment and is inhibited by Cladosporium fulvum effector protein AVR2. We also found that PLCP C14 is activated by 0.03% SDS in native AFs and is inhibited by Phytophthora infestans effector proteins EPIC1/2B. (ii) Using FP, we showed diversity of serine hydrolase activities in leaf extracts of unchallenged and Botrytis cinerea-infected Arabidopsis plants. We also detected differentials of serine hydrolase activities in tomato leaf AFs upon BTH treatment. (iii) Using MV151, we labeled three catalytic β subunits of the plant proteasome, and showed selective inhibition by aldehyde-based inhibitors. We also discovered a posttranslational, NPR1-dependent upregulation of proteasome activities upon BTH treatment in Arabidopsis. (iv) While characterizing IS4 profiling in Arabidopsis leaf extracts, we found that IS4 labeling occurs at N-terminus of chloroplast protein PsbP through a peptide bond and requires activity of PLCP RD21. This finding eventually led us to the discovery that RD21 acts as a peptide ligase in vitro. In conclusion, we demonstrated that ABPP is a powerful tool to dynamically track protein activities in plants, which facilitates the discovery and functional analysis of enzymes.

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Thesis (PhD thesis)

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Activity-based protein profiling in plants	English

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Abstract

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Activity-based probes (ABPs) sind von Inhibitoren abgeleitet, die kovalent mit einem Reportermolekül verknüpft sind und mit aktiven Enzymen reagieren können. Der Einsatz von ABPs in activity-based protein profiling (ABPP) erlaubt es aktive Enzyme in einem komplexen Proteom sichtbar zu machen. In dieser Arbeit wurde eine Kollektion solcher ABPs durchmustert und dahingehend charakterisiert, wie sie mit Arabidopsis Blattextrakten und der apoplastischen Flüssigkeit (AFs) aus Tomatenblättern reagieren. In der Folge wurden vier ABPs genauer untersucht: die Epoxydsonde DCG-04, die Fluorophosphonatsonde FP, die Vinylsulfonsonde MV151 und die β-Lactonsonde IS4. Als erster Schritt wurden die optimalen Reaktionsbedingungen abgesteckt. Dann wurden vergleichende ABPP Experimente durchgeführt, bei denen Enzyme identifiziert wurden, deren Aktivität während Benzothiadiazole (BTH)-induzierter Pflanzenabwehr und Pathogeninfektion unterschiedlich waren. In einem dritten Schritt wurden kompetitive ABPPs durchgeführt, deren Ziel es war Zielproteine von Pathogen abgeleiteten und synthetischen Inhibitoren zu identifizieren. Folgende Erkenntnisse wurden gewonnen: (i) Durch den Einsatz von DCG-04 gelang es in den AFs von Tomatenblättern sieben Papain-ähnliche Cysteinproteasen (PLCPs) zu identifizieren. Die Aktivität einer dieser PLCPs, PIP1 war während BTH-Behandlung signifikant erhöht, wurde aber inhibiert durch das Effektorprotein Avr2 aus Cladosporium fulvum. Es wurde außerdem gezeigt, dass das PLCP C14 durch 0,03% SDS im sonst unbehandelten AF aktiviert wird und dass die Effektorproteine EPIC1/2B aus Phytophthora infestans diese Aktivität inhibieren. (ii) Durch den Einsatz von FP wurde gezeigt, wie verschieden die Aktivität von Serinhydrolasen in Blattextrakten von unbehandelten und Botrytis cinerea-infizierten Arabidopsispflanzen ist. Unterschiede in der Serinhydrolaseaktivität konnten auch in BTH-behandelten und -unbehandelten Tomaten AFs gezeigt werden. (iii) Mit der Sonde MV151 wurden die katalytischen Untereinheiten des Pflanzenproteasoms markiert und die Selektivität von Aldehyd-Inhibitoren gezeigt. Außerdem wurde die Beobachtung gemacht, dass BTH-Behandlung in Arabidopsis zu einer posttranslationalen, NPR1-abhängigen Hochregulierung der Proteasomaktivität führt. (iv) Während der Charakterisierung von IS4 in Arabidopsis Blattextrakten wurde beobachtet, dass IS4 über eine Peptidbindung mit dem N-Terminus des Chloroplastenproteins PsbP verknüpft wird und dass diese Reaktion die Anwesenheit der PLCP RD21 voraussetzt. Diese Beobachtung führte schließlich zur Entdeckung, dass RD21 in vitro als Peptidligase fungiert. Insgesamt wurde gezeigt, dass ABPP eine sehr potente Methode ist die Aktivität von Proteinen in Pflanzen dynamisch zu verfolgen und dass diese Methode die Entdeckung und funktionelle Analyse von Enzymen erheblich erleichtert.

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