Plant cuticle development: insights from molecular cloning of CER13 and protein-protein interaction studies

Teodor, Roxana-Iuliana (2009). Plant cuticle development: insights from molecular cloning of CER13 and protein-protein interaction studies. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Cuticle, the outermost layer covering all primary aerial surfaces of vascular land plants, is essential for the protection and normal development of the plant and has as main components cutin and wax. Although numerous genes are involved in the biosynthesis and regulation of cuticular components, only few have a known function. To contribute to the understanding of regulatory mechanisms involved in cuticle development, two approaches have been taken in this project. These involved on the one hand mapping and characterizing a locus involved in wax regulation and metabolism and on the other hand, identifying putative interactors for three proteins involved in cuticular pathways. The first approach concerns the mapping and characterization of eceriferum13 (cer13) mutant Arabidopsis thaliana. Obtained in Ler-0 background by fast neutron treatment, the cer13 mutant has less epicuticular wax and its semi-dwarf phenotype, as well as its responsiveness to photoperiod indicate a possible implication in regulatory mechanisms. After fine mapping to a region of 46 candidate genes, RESURRECTION1 (RST1, AT3G27670) was selected as candidate for CER13, due to the fact that its mutation causes altered epicuticular wax phenotype. Sequence analysis of RST1, encoding a putative transmembrane protein of unknown function, revealed a 950 bp deletion resulting in a frame shift and a premature STOP codon in CER13 cDNA. The allelism test performed by crossing cer13 to rst1-3 was positive, indicating a single locus. To investigate the mechanism responsible for the reduced wax levels in cer13, we performed a wholegenome ATH1 microarray analysis. Previously, the biochemical pattern of wax composition was found to be highly similar between cer13, cer3 and cer7. Interestingly, CER3 is down-regulated in both cer13 and cer7 transcriptomes, indicating that the three genes could be involved in the same pathway. We also compared cer13-misregulated genes to a MASTA (MicroArray overlap Search Tool and Analysis) database of more than 600 microarray datasets. This analysis suggested that CER13 provides a link between wax biosynthesis and salicylic acidmediated signaling, as well as similar expression patterns to cold and drought stress. The second approach undertaken in this study consists in using three cuticular genes as baits in a Y2H cDNA library screening. All three genes that were selected for this screening are involved in the cuticle development in an unusual manner. The putative interactors found for the subtilisin-like serine protease ALE1, which is required for the proper formation of epidermis and cuticle around the embryo(Tanaka et al., 2001), are subunits a and b of the CSN5, a component of the COP9 signalosome. The putative acyl transferase CER2 is particular in that it localizes to the nucleus. A porin and two immunophilins were identified as putative interactors. The PALMITOYL PROTEIN THIOESTERASE (PPT) is a gene up-regulated in three independent cuticular mutants and an ATP-dependent helicase as well as an ADPribosilation factor were isolated as putative interactors. These results highlight the complexity of the regulatory mechanisms behind the formation and the function of the cuticle and contribute to the understanding of plant defenses.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Die Kutikula, die äußerste, alle primären oberirdischen Organe von Gefäßpflanzen bedeckende Schicht, ist unerläßlich zum Schutz und für die normale Entwicklung der Pflanze und besteht hauptsächlich aus Cutin und Wachsen. Wenngleich zahlreiche Gene in Biosynthese und Regulation von cuticulären Bestandteilen involviert sind, ist doch nur für wenige eine genaue Funktion bekannt. Um zu einem besseren Verständnis regulatorischer Mechanismen, die an der Kutikula-Entwicklung beteiligt sind, beizutragen, wurden im Rahmen dieses Projektes 2 Strategien verfolgt. Dazu gehörte auf der einen Seite die Kartierung und Charakterisierung eines an Wachs-Metabolismus und �Regulation beteiligten Gen- Locus und auf der anderen Seite die Identifizierung putativer Interaktoren dreier Proteine, die in kutikuläre Entwicklungswege involviert sind. Im Rahmen der ersten Strategie wurde die Arabidopsis thaliana eceriferum13 (cer13) Mutante kartiert und charakterisiert. Die cer13 Mutante - durch Bombardierung mit schnellen Neutronen im Ler-0 Hintergrund erhalten - besitzt weniger epicuticuläres Wachs und sowohl ihr halb-zwergenwüchsiger Phänotyp als auch ihre photoperiodische Sensitivität, geben einen Hinweis auf eine mögliche Beteiligung an regulatorischen Mechanismen. Nachdem durch Fein-Kartierung eine Eingrenzung auf eine Region mit 46 putativen Kandidaten-Genen erreicht werden konnte, wurde RESURRECTION1 (RST1, AT3G27670) als Kandidat for CER13 ausgewählt, da eine Mutation dieses Gens einen veränderten epicuticulären Wachs-Phänotyp verursacht. Sequenz-Analyse von RST1, das für ein putatives Transmembran-Protein unbekannter Funktion codiert, offenbarte das Vorhandensein eine 950 bp umfassenden Deletion in der CER13 cDNA, die eine Verschiebung des Leserahmens und ein vorzeitiges STOP-Codon zur Folge hat. Durch Kreuzung von cer13 mit rst1-3 konnte der allelische Charakter der Mutationen bestätigt werden, was für die Verantworlichkeit eines einzelnen Locus spricht. Um die Mechanismen zu untersuchen, die für den reduzierten Wachsgehalt in cer13 verantwortlich sind, wurde eine ATH1 Microarray Analyse durchgeführt. Zuvor war die große Ähnlichkeit des biochemischen Musters der Wachs-Zusammensetzung in cer13, cer3 und cer7 beschrieben worden. Interessanterweise ist CER3 sowohl in cer13 also auch im cer7 Transkriptome herunterreguliert, was darauf hindeutet, dass die drei Gene in einen gemeinsamen Entwicklungsweg involviert sind. Ein Vergleich der in cer13 missregulierten Gene mit einer MASTA (MicroArray overlap Search Tool and Analysis) Datenbank von über 600 Microarray- Experimenten legte nahe, dass CER13 eine Verbindung zwischen Wachs- Biosynthese und Salicylsäure-vermittelten Signalwegen herstellt, und zeigte Ähnlichkeit des Transkriptmuster der Mutante mit Kälte- und Trockenstreß- Bedingungen. Die zweite hier verfolgte Strategie bestand im Durchmustern einer Yeast-2-Hybrid-Bibliothek, zur Identifizierung der Interaktoren dreier für die Kutikula-Entwicklung relevanter Proteine. Putative Interaktoren für die Subtilisin-ähnliche Serine-Protease ALE1, die für korrekte Ausbildung von Epidermis und Kutikula des Embryos (Tanaka et al., 2001), benötigt wird, sind die Untereiheiten a und b von CSN5, einer Komponente des COP9 Signalosoms. Die putative Acyl-Transferase CER2 ist besonders in ihrer nukleären Lokalisierung. Ein Porin und 2 Immunophiline wurden als putative Interaktoren identifiziert. Für PALMITOYL PROTEIN THIOESTERASE (PPT), ein in drei unabhängigen Kutikula-Mutanten hochreguliertes Gen, wurden eine ATP-abhängige Helicase und ein ADP-Ribosilierungsfaktor als putative Interaktoren identifiziert. Diese Ergebnisse betonen die Komplexität regulatorische Mechanismen, die der Bildung und Funktion der Kutikula zugrundeliegen und tragen zum Verständnis der pflanzlichen Abwehr bei.

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