Transkriptionelle Regulation von pipe und dessen Einfluss auf die dorsoventrale Musterbildung in Drosophila melanogaster

Knispel, Meike (2012). Transkriptionelle Regulation von pipe und dessen Einfluss auf die dorsoventrale Musterbildung in Drosophila melanogaster. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Zusammenfassung Die Polarität der dorsoventralen (DV-) Achse in Drosophila melanogaster wird schon wäh-rend der Oogenese festgelegt. Im Bereich des am anterioren Kortex lokalisierten Oozyten-kerns wird der EGFR-Ligand Gurken in den Perivitellinspalt (PVS) sezerniert und aktiviert den EGF-Signalweg in umliegenden Follikelzellen. In diesen, nun als dorsal determinierten, Zellen wird ein Transkriptionsfaktor (TF) aktiviert, der die Expression von pipe auf den ven-tralen Bereich der Eikammer beschränkt. Die dorsale Repression wird von dem Repressor-element Motiv B vermittelt, das innerhalb des 1,5 kb langen essentiellen pipe-Promotors liegt. Unter Kontrolle dieses Promotors wurde ein EGFP-Pipe-Fusionsprotein exprimiert, mit dem die Präsenz des Pipe-Proteins in ventralen Follikelzellen und dessen subzelluläre Loka-lisation im Golgi-Kompartiment visualisiert werden konnte. Außerdem konnte mit diesem Konstrukt gezeigt werden, dass die Deletion des Motiv B oder weiterer Promotorsequenzen (Motiv 69) nicht zur vollständigen Derepression von pipe führt. Durch Reportergenanalysen in Drosophila Schneider 2-Zellkulturen und in vivo wurde auch verifiziert, dass Motiv B oder dessen Erweiterung Motiv 69 allein nicht ausreichen die dorsale pipe-Repression zu vermitteln. Im pipe-Promotor konnten noch weitere stark konservierte Sequenzen, die möglicherweise als zusätzliche Repressorelemente dienen, identifiziert werden. Deren Funktion wurde aber noch nicht untersucht. Stattdessen wurde geprüft, ob die unvollständige Derepression von pipe durch post-transkriptionelle Regulation bedingt wird. Zwar führte die Deletion potentieller Bindestellen für microRNAs zu einer Erhöhung der EGFP-Pipe-Expression, dessen räumliche Verteilung in Eikammern wurde dadurch aber nicht verändert. Mittels DNA-Affinitätschromatographie, Promotoranalysen sowie RNAi-Experimenten wurde versucht den Transkriptionsfaktor zu finden, der die identifizierten Repressorelemente bindet. Ein ETS-verwandtes Gen wurde als potentieller Regulator des pipe-Repressors ausgemacht, der Repressor selbst konnte aber nicht identifiziert werden. Inzwischen ist Mirror von zwei Arbeitsgruppen parallel als EGF-abhängiger transkriptioneller Repressor von pipe bestätigt worden. Die auf die ventralen 40% der Follikelzellen begrenzte Expression von pipe führt zur asym-metrischen Modifikation von Komponenten der Eihülle wie dem Vitelline membrane-like (VML) Protein. Hierdurch wird die proteolytische Aktivierung des Toll-Liganden Spätzle ventral initiiert. Die lokale Produktion und Diffusion von aktiviertem Spätzle etabliert den intranukleären Dorsal-Gradienten im Embryo. Durch die Analyse ektopischer VML-RFP markierter pipe-exprimierender Klone wurde bestätigt, dass der Dorsal-Gradienten von der Diffusion eines Faktors im PVS abhängt und durch laterale Inhibition etabliert und stabilisiert wird. Die Beobachtung, dass trotz uniformer pipe-Expression DV-Polarität zu beobachten ist, deutet darauf hin, dass neben der notwendigen enzymatischen Funktion von pipe ein weiterer Faktor an der Initiierung des ventralen Achsen-Pols beteiligt ist.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Abstract Polarity of the dorsoventral axis in Drosophila melanogaster is already determined during oogenesis. Grk protein is secreted into the perivitelline space in a region nearby the oocyte nucleus which is positioned at the anterior-dorsal cortex of the oocyte. Activated EGF-signaling in adjacent follicle cells induces them to adopt a dorsal fate. They express an EGF-dependent transcription factor which represses pipe and thus restricts pipe transcription to the ventral part of the egg chamber. Repression of pipe is mediated by a repressor element called Motif B, which is found in the 1.5 kb region essential for pipe expression. Using this promoter, an EGFP-Pipe fusion protein was expressed to visualize the presence of Pipe protein in ventral follicle cells and the Golgi compartment. Furthermore, this construct was used to show that neither the deletion of Motif B nor of Motif 69 resulted in complete derepression of pipe. Reporter gene assays in Drosophila Schneider 2 cell culture and in vivo analysis revealed that neither Motif B nor its extended version Motif 69 alone are sufficient to mediate dorsal pipe repression. In agreement with these findings, highly conserved sequences were identified outside the region harboring Motif B and Motif 69, which could serve as additional repressor elements. Their function has not been analyzed. However, we investigated whether the incomplete derepression of pipe is due to post-transcriptional regulation. Although the deletion of potential binding sites for microRNAs led to increased EGFP-Pipe expression, the spatial distribution was not altered in egg chambers. DNA affinity chromatography, promoter analysis, and RNAi experiments were performed to isolate a transcription factor (TF), which binds the cis-regulatory element. While no candidate TFs were found using bioinformatics or biochemistry, in vivo studies showed that one of the ETS-related genes might act as a potential regulator of a pipe repressor. Recently, two labs independently identified Mirror as an EGF-dependent transcriptional repressor of pipe. Finally, asymmetric expression of pipe in the ventral-most 40% of follicle cells leads to an enzymatic modification of eggshell components, including Vitelline membrane-like (VML) protein. This defines the region where the Toll ligand Spätzle is proteolytically activated. Subsequent diffusion of activated Spätzle establishes the embryonic Dorsal gradient. Analysis of ectopic pipe clones marked with VML-RFP show that establishment and stabilization of the gradient depends on lateral inhibition and on diffusion of a factor which derives from the perivitelline space. Due to the fact that even uniform pipe expression allows the establishment of DV polarity, it is very likely that, in addition to Pipe´s enzymatic function, yet another factor is involved in the initiation of dorsoventral polarity.

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