Universität zu Köln

Kirsch, Katja Meike (2014). The impact of CO2 on inorganic carbon supply and pH homeostasis in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The actinobacterium C. glutamicum is a soil bacterium which is extensively used in biotechnology, especially in the production of L-glutamate and L-lysine. An important aspect of industrial scale fermentation processes with high cell densities is the formation of large amounts of CO2. Since CO2 is assumed to influence inorganic carbon provision as well as the internal pH of C. glutamicum, both aspects were investigated in this study. For a sufficient supply with inorganic carbon, the ß-type carbonic anhydrase Bca is essential, especially at low external pH values, since conversion of CO2 to bicarbonate (HCO3-) is crucial before it can serve as a substrate for PEP and pyruvate carboxylation reactions. Although Bca activity also leads to an accelerated proton formation, the pH homeostasis seems not to be affected by this enzyme. Also, elevated CO2 in the supply air did not lead to impaired growth and showed only short term effects on pH homeostasis. A lack of Bca leads to a growth deficit of the deletion mutant C. glutamicum Δbca. This can be compensated by the heterologous expression of genes encoding a cyanobacterial system for bicarbonate import, called SbtAB. Although this component of the carbon concentrating mechanism of Synechocystis sp. PCC 6803 is able to provide inorganic carbon in C. glutamicum, there were only slight benefits observed in C. glutamicum wild type, including elevated growth rates on glucose and partly on pyruvate. The activity of SbtAB could be determined in uptake measurements using radio-labelled bicarbonate. The impact of SbtAB on pH homeostasis is negligible. To investigate the pH homeostasis of C. glutamicum, a fluorescence based assay for online detection of the intracellular pH was established using the ratiometric GFP variant pHluorin. The dynamic of the homeostasis process was determined and the results show the ability of C. glutamicum to perform effective pH homeostasis at external pH values from 6 to 8.5. Various possible components of the pH homeostasis machinery were observed by determination of the pH homeostasis capacity of the according deletion mutants. A complete lack of both branches of terminal oxidases of the respiratory chain leads to collapse of the pH homeostasis, while the absence of only one branch does not affect the ability to perform pH homeostasis. Also the absence of the F(1)F(O)ATPase has no effect on the of pH homeostasis in C. glutamicum.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Der Einfluß von CO2 auf die Versorgung mit anorganischem Kohlenstoff und die pH-Homöostase in Corynebacterium glutamicum German
Translated abstract:	Abstract Language Bei dem Actinobacterium C. glutamicum handelt es sich um ein Bodenbakterium, das stark in der Biotechnologie genutzt wird, vor allem für die Produktion von L-Glutamat und L-Lysin. Ein wichtiger Aspekt bei der industriellen Fermentation mit hohen Zelldichten ist die Bildung großer Mengen CO2. Da in C. glutamicum CO2 die Versorgung mit anorganischem Kohlenstoff ebenso beeinflusst wie den internen pH-Wert, wurden beide Aspekte in dieser Arbeit untersucht. Für die ausreichende Versorgung mit anorganischem Kohlenstoff ist die ß-Carboanhydrase Bca vor allem bei niedrigem externen pH essentiell, denn die Umwandlung von CO2 zu Hydrogencarbonat (HCO3-) ist entscheidend, damit es als Substrat für die Carboxylierung von PEP und Pyruvat zur Verfügung steht. Obwohl Bca-Aktivität auch zu einer beschleunigten Protonenbildung führt, scheint die pH-Homöostase durch das Enzym nicht beeinflusst zu sein. Auch erhöhte CO2-Konzentrationen in der Zuluft haben keinen wachstumshemmenden Effekt und führten nur zu kurzen Effekten in Bezug auf pH-Homöostase. Ein Fehlen von Bca führt zu einem Wachstumsdefizit der Deletionsmutante C. glutamicum Δbca. Dieses kann durch die heterologe Expression von Genen ausgeglichen werden, die für ein cyanobakterielles Hydrogencarbonat-Aufnahmesystem kodieren, genannt SbtAB. Obwohl diese Komponente des Kohlenstoff-konzentrierenden Systems aus Synechocystis sp. PCC 6803 anorganischen Kohlenstoff in C. glutamicum bereitstellen kann, sind die positiven Auswirkungen auf den Wildtyp gering und beinhalten erhöhte Wachstumsraten auf Glukose und zum Teil auf Pyruvat. Die Aktivität von SbtAB konnte mit radiochemisch markiertem Hydrogencarbonat bestimmt werden. Zur Untersuchung der pH-Homöostase in C. glutamicum wurde ein Fluoreszenz-basiertes System zur online-Detektion entwickelt, das das ratiometrische GFP-Derivat pHluorin nutzt. Die Dynamik des Homöostaseprozesses konnte bestimmt werden, und die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von C. glutamicum, zwischen pH 6 und 8,5 effektiv pH-Homöostase zu betreiben. Verschiedene Komponenten, die an der pH-Homöostase beteiligt sind, wurden mit den entsprechenden Deletionsmutanten untersucht. Das Fehlen beider Endoxidasen der Atmungskette führt zum Kollaps der pH-Homöostase, während das Fehlen nur einer Komponente die Homöostasefähigkeit nicht beeinflusst. Das Fehlen der F(1)F(O)ATPase hat keine Auswirkung auf die pH-Homöostase in C. glutamicum. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kirsch, Katja Meike kirsch-k@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-55451
Date:	2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium glutamicum; pH homeostasis; inorganic carbon; UNSPECIFIED
Date of oral exam:	14 March 2014
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr. Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5545