Universität zu Köln

Steckelberg, Anna-Lena (2014). CWC22 Supports Pre-mRNA Splicing and Exon Junction Complex Assembly. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The exon junction complex (EJC) is a multi-protein complex that assembles on mRNA during splicing. It binds upstream of exon-exon junctions and preserves the positional information of the former splice sites within the mRNP architecture. In metazoan cells, the EJC coordinates several key aspects of gene expression, such as mRNA export, cytoplasmic localization, translation efficiency and quality control by nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Although the composition of EJCs is well understood, the mechanism mediating splicing-dependent EJC assembly and the factor(s) recruiting the EJC to the spliceosome remain elusive. Here, I describe the identification of CWC22 as an essential splicing factor that is required for EJC assembly in human cells. The central domain (MIF4G) of CWC22 directly interacts with the EJC core protein eIF4A3, and this interaction is reminiscent of the eIF4A/eIF4G translation initiation complex. The interaction with CWC22 recruits eIF4A3 to the early spliceosomal complex and initiates EJC assembly. Mutations in eIF4A3 that disrupt the interaction with CWC22 also prevent splicing-dependent EJC assembly, but do not affect the formation of splicing-independent EJCs from recombinant components in vitro. Interestingly, CWC22 is also required for pre-mRNA splicing, and unspliced pre-mRNAs accumulate in CWC22-depleted cells. Complementation assays revealed that a central segment of CWC22, comprising of the MIF4G and an adjacent MA3 domain, supports pre-mRNA splicing in CWC22-depleted cells. By regulating both pre-mRNA splicing and EJC assembly, CWC22 plays a dual role in mammalian gene expression. The two functions of CWC22 can be experimentally separated, since over-expression of a CWC22-mutant that is unable to bind eIF4A3 inhibits EJC assembly without affecting pre-mRNA splicing. Over-expression of this mutant is highly toxic to cells, demonstrating the importance of EJCs for gene regulation in human cells. Taken together, CWC22 represents the first direct link between the splicing machinery and the EJC, and the discovery of its dual function during pre-mRNA splicing highlights the complex interconnection of individual processing steps during mammalian gene expression.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language CWC22 unterstützt pre-mRNA Spleißen und den Zusammenbau von Exon-Verbindungs Komplexen UNSPECIFIED
Translated abstract:	Abstract Language Pre-mRNA Spleißen in Säugerzellen beeinflusst die Proteinzusammensetzung von Ri-bonucleoproteinkomplexen (mRNP). Ein prominentes Beispiel hierfür ist der Exon- Verbindungs Komplex (‘exon junction complex’, EJC), der die gespleißte mRNA nahe der Exon-Exon Grenze bindet und so die ehemaligen Spleiß-Stellen markiert. Der EJC koordiniert viele wichtige Aspekte der Genexpression, so zum Beispiel den Export der mRNA ins Zytoplasma, ihre zelluläre Lokalisation, die Translations-Effizienz und die Qualitätskontrolle durch den Mechanismus des Nonsens-vermittelte mRNA-Abbaus (NMD). Doch obgleich die Zusammensetzung des EJC intensiv untersucht wurde, blieb bislang unklar, wie das Spleißosom den Zusammenbau des Komplexes reguliert. In dieser Studie beschreibe ich nun die Identifikation von CWC22 als einen essentiellen Spleiß-Faktor, der den Zusammenbau des EJC in humanen Zellen vermittelt. Die mitt-lere Domäne (MIF4G) von CWC22 bindet direkt an das zentralen EJC Protein eIF4A3. Diese Bindung wiederum vermittelt die Interaktion zwischen eIF4A3 und dem Spleißo-som. Bemerkenswert ist, dass CWC22 auch für das Spleißen von pre-mRNA benötigt wird. Diese Spleiß-Funktion des Proteins wird von einem zentralen Segment, bestehend aus der MIF4G Domäne und der benachbarten MA3 Domäne, vermittelt. Indem CWC22 sowohl das Spleißen von pre-mRNA, als auch den Aufbau von EJCs reguliert, nimmt das Protein eine duale Rolle in der Genregulation von Säugerzellen ein. Interessanterweise lassen sich beide Funktionen experimentell trennen, so dass die Überexpression einer dominant negativen Muntante von CWC22 zwar den Aufbau von EJCs inhibiert, gleichzeitig aber keinen Effekt auf das Spleißen von pre-mRNA hat. Die Überexpression dieser Mutante hat einen toxischen Effekt auf kultivierte Zellen, was die Bedeutung des EJC für die Kontrolle der Genexpression unterstreicht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protein CWC22 die erste direkte Verbin-dung zwischen dem EJC und dem Spleißosom darstellt, während die duale Funktion des Proteins die Komplexität der Genregulation in Säugerzellen illustriert. UNSPECIFIED
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Steckelberg, Anna-Lena lena.steckelberg@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-60162
Date:	May 2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language RNA biology, exon junction complex, pre-mRNA splicing, DEAD box helicase English
Date of oral exam:	1 July 2014
Referee:	Name Academic Title Gehring, Niels PD Dr. Schnetz, Karin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6016