Universität zu Köln

Miranda Vergara, Maria del Pilar (2018). Mitochondrial DNA gene expression and consequences of its loss in mammals. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mitochondria are intracellular organelles that fulfil multiple essential functions, including the generation of the vast majority of the cellular energy currency adenosine triphosphate (ATP) via the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system. Mitochondrial dysfunction is found in severe inherited metabolic disorders with a broad clinical spectrum, in several common age-related diseases, and has been associated with the ageing process itself. Mitochondrial biogenesis depends on the expression of two cellular genomes. While the mitochondrial genome (mtDNA) encodes a few essential subunits of the OXPHOS system and the transfer and ribosomal RNAs required to translate these subunits in mitochondria, most mitochondrial proteins are encoded in the nuclear genome (nDNA). The mechanisms regulating the expression of mtDNA are still largely unknown and how disrupting this process leads to pathogenic phenotypes is poorly understood. The first aim of this thesis was to elucidate the in vivo function of the mitochondrial RNA polymerase (POLRMT) in the regulation mtDNA gene expression. We generated and characterized transgenic mouse models with varying gene dosage of Polrmt to investigate the role of POLRMT and the splice variants of the Polrmt gene in mammals. These Polrmt models included a whole-body knockout, a heart and skeletal muscle knockout, a heterozygous knockout, and an overexpressing mouse strain. Our findings reveal that Polrmt only codes for a mitochondrial isoform, POLRMT, and that no other RNA polymerase can replace its function. We show that POLRMT has two essential roles in mammalian mitochondria, i) it is the only RNA polymerase transcribing mtDNA, and ii) it synthesizes the RNA primers required for mtDNA replication. Moreover, our data suggests that POLRMT is part of a mechanism involving promoter-specific transcription initiation that coordinates the switch between mtDNA replication and transcription. Finally, we show that POLRMT is the limiting factor for transcription initiation and that it is frequently loading at the promoters to initiate transcription, whereas productive near-genome length mitochondrial RNA (mt-RNA) synthesis is regulated at the elongation level. The second aim of this thesis was to investigate the cellular consequences of disrupting mtDNA gene expression and the progression of OXPHOS deficiency. We performed a systematic comparison of the mitoproteome and total cellular transcriptome from heart of five knockout mouse models, each deficient in an essential factor acting at a specific level of gene expression regulation. We also studied the mitoproteome changes during normal post-natal development in mouse heart and followed proteome changes in a model with progressive OXPHOS deficiency in the heart. Surprisingly, we found a decline in the intra-mitochondrial Q biosynthesis pathway that correlates with the progressive OXPHOS deficiency. Furthermore, we found that cellular stress responses, likely mediated by the myc proto-oncogene protein (MYC) and the cyclic AMP-dependent transcription factor ATF4 (ATF4) transcription factors, are activated very early in the progression of OXPHOS deficiency. These cellular responses include the upregulation of enzymes of the mitochondrial one-carbon (1C) pathway, proline synthesis, and mitochondrial proteases and chaperones. In conclusion, the work presented in this thesis has identified fundamental mechanisms of regulation of mtDNA gene expression in vivo and pinpointed primary and secondary consequences of impaired expression of mtDNA. This work has not only important implications for our understanding of the function of this essential organelle but it has also identified novel mechanisms involved in mitochondrial pathology that can be relevant for patient diagnosis and future treatment strategies.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Mitochondrien sind intrazelluläre Organellen, die verschiedene essenzielle Funktionen haben wie die Produktion des Hauptanteils zellulärer Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS). Mitochondriale Fehlfunktionen treten bei schweren metabolischen Erberkrankungen mit breitem klinischen Spektrum auf, sowie in verschiedenen altersbedingten Erkrankungen, und wurden außerdem mit dem Altersprozess assoziiert. Die mitochondriale Biogenese hängt von der Exprimierung zweier zellulärer Genome ab. Während das mitochondriale Genom (mtDNA) für ein paar wenige essentielle Untereinheiten des OXPHOS Systems, sowie für Transfer- und Ribosomalen-RNAs die zur Translation dieser Untereinheiten in den Mitochondrien notwendig sind, kodiert, ist der Großteil der mitochondrialen Proteine nuklear kodiert (nDNA). Die Mechanismen, die die Expression der mtDNA regulieren, sind größtenteils unbekannt, und wie Störungen dieser Prozesse zu einem pathogenen Erscheinungsbild führen, ist nur unzureichend verstanden. Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war es zu untersuchen welche in vivo Rolle die mitochondriale RNA Polymerase (POLRMT) in der Regulation der Exprimierung der mtDNA spielt. Um die Funktion von POLRMT und Spleißvarianten des Polrmt Gens in Säugern zu analysieren, haben wir transgene Mausmodelle mit verschiedenen Gendosierungen von Polrmt hergestellt und charakterisiert. Zu diesen Polrmt Modellen zählten ein homozygoter Ganzkörperknockout sowie ein gewebespezifischer Knockout in Herz- und Skelettmuskel, ein heterozygoter Knockout, und einen überexprimierenden Mausstamm. Unsere Studien ergeben, dass Polrmt nur für ein mitochondriales Protein, POLRMT, kodiert, und dass keine andere RNA Polymerase seine Funktion ersetzen kann. Wir zeigen dass POLRMT zwei essenzielle Rollen in Säuger-Mitochondrien hat, i) sie ist die einzige RNA Polymerase die die mtDNA transkribiert, und ii) sie synthetisiert die für die Replikation der mtDNA essentiellen RNA Primer. Desweiteren deuten unsere Daten darauf hin, dass POLRMT Teil eines Prozesses ist, der durch einen promoterspezifischen Transkriptionsstart den Wechsel zwischen mtDNA Replikation und Transkription koordiniert. Abschließend zeigen wir, dass POLRMT der limitierende Faktor für den Transkriptionsstart ist, und dass POLRMT regelmäßig zum Transkriptionsstart an die Promotoren bindet, wohingegen die Synthese von fast genomlanger mitochondrialer RNA (mt-RNA) auf der Ebene der Elongation reguliert ist. Das zweite Ziel dieser Dissertation war es die zellulären Konsequenzen defekter Gen-Expression der mtDNA und fortschreitender OXPHOS Fehlfunktion zu erforschen. In einer systematischen Studie haben wir das mitochondriale Proteom (Mitoproteom) und das komplette zelluläre Transkriptom vom Herz von fünf Knockout Mausstämmen von denen jeder defekt für einen essenziellen Faktor für die Regulation der mtDNA Gen-Expression ist, miteinander verglichen. Desweiteren haben wir Veränderungen des Mitoproteoms während der postnatalen Entwicklung des Mausherzens untersucht und Unterschiede im Mitoproteom in einem Mausstamm mit fortschreitender OXPHOS Fehlfunktion verfolgt. Überraschenderweise haben wir entdeckt, dass eine Minderung des intra-mitochondrialen Coenzym Q (Q) Biosynthesestoffwechsels mit fortschreitender OXPHOS Fehlfunktion einher geht. Weiter haben wir gefunden, dass die zelluläre Stressreaktion sehr früh während der fortschreitender OXPHOS Fehlfunktion aktiviert wird, wahrscheinlich durch die Transkriptionsfaktoren myc Protoonkogen Protein (MYC) und zyklischer AMP-abhängiger Transkriptionsfaktor ATF4 (ATF4). Diese zelluläre Antwort umfasst eine Erhöhung der Enzyme des mitochondrialen Kohlenstoffkreislaufes (1C), der Prolinsynthese und der mitochondrialen Proteasen und Chaperone. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass die hier präsentierte Arbeit fundamentale Mechanismen der Regulation der mtDNA Gen-Exprimierung in vivo identifiziert hat, und primäre und sekundäre Konsequenzen defekter Expression der mtDNA genau festlegt. Diese Arbeit ist nicht nur von außerordentlich wichtiger Bedeutung für unser Verständnis der Funktion dieses essentiellen Organells, sondern hat außerdem neue Mechanismen, die in mitochondrialen Krankheitsbildern eine Rolle spielen, identifiziert, was für die Diagnose von Patienten und zukünftigen Behandlungsstrategien bedeutend ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Miranda Vergara, Maria del Pilar mpmirandav88@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-86615
Date:	2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language mitochondrial gene expression English mitochondrial RNA polymerase English mitochondrial dysfunction English
Date of oral exam:	4 September 2018
Referee:	Name Academic Title Larsson, Nils-Göran Prof. Dr. Trifunovic, Aleksandra Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8661