Universität zu Köln

Widmer, Heidi (2018). Functional characterisation of a fungal endonuclease effector and regulated host cell death. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The mutualistic root endophyte Serendipita indica leads to growth promotion and enhanced resistance to abiotic and biotic stresses in many experimental hosts. Due to its versatility, broad host range and ability to grow in axenic culture S. indica emerged as the model species in the fungal order Sebacinales. Furthermore, its genome is available and the fungus is genetically tractable. To further develop the molecular tools for functional characterisation of effector proteins a protein production system for purification of secreted proteins was established in S. indica using the inducible promoter SiFGB1. Modular vectors and culture conditions were improved for expression and secretion of homologous and heterologous proteins. In addition, gene deletion via homologous recombination using a split resistance cassette was developed in S. indica. After an initial biotrophic phase, S. indica triggers cell death during compatible root colonisation. The fungal elicitors and effectors, which initiate and regulate this root cell death are unknown. To better characterise the mechanisms involved in fungal-mediated root cell death nuclei disappearance was analysed in colonised Arabidopsis roots with different stainings by confocal laser scanning microscopy. Additionally, a fungal- secreted endonuclease named SiNUCA was found in the apoplastic fluid of colonised barley roots, functionally characterised and its involvement in cell death examined. SiNUCA revealed to be a conserved small secreted protein belonging to the His-Me finger endonucleases. Characterisation of SiNUCA by heterologous expression in Ustilago maydis and by purification of the protein from S. indica culture filtrate showed that SiNUCA has sugar non-specific nuclease activity. Ectopic expression in Arabidopsis led to higher colonisation levels and more root cell death. SiNUCA localised to the plant nucleus at later colonisation stages where it could function as an executor of plant cell death. In the apoplast, SiNUCA could be involved in inactivation of the damage- associated molecular pattern extracellular DNA.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Funktionelle Charakterisierung eines pilzlichen Endonuklease Effektors und regulierter Wirtszelltod German
Translated abstract:	Abstract Language Der mutualistische Wurzelendophyt Serendipita indica fördert das Pflanzenwachstum und führt zu erhöhter Resistenz gegen abiotische und biotische Stressfaktoren in vielen experimentellen Wirtspflanzen. S. indica hat sich durch seine Anpassungsfähigkeit, sein großes Wirtsspektrum und die Fähigkeit auch in axenischen Kulturen wachsen zu können, zum Modellorganismus der Pilzordnung Sebacinales entwickelt. Zusätzlich ist das Genom sequenziert und der Pilz ist transformierbar. Um die molekularen Werkzeuge für die funktionelle Charakterisierung von Effektorproteinen weiterzuentwickeln, wurde ein Proteinproduktionssystem mit Hilfe des induzierbaren SiFGB1 Promotors zur Aufreinigung von sekretierten Proteinen in S. indica etabliert. Modulare Vektoren und Kulturkonditionen wurden für die Expression und Sekretion von homologen und heterologen Proteinen verbessert. Außerdem wurde ein Gendeletionssystem basierend auf homologer Rekombination mit einer geteilten Resistenzkassette in S. indica entwickelt. S. indica löst nach einer anfänglichen biotrophen Phase Zelltod während der kompatiblen Pflanzenbesiedlung aus. Die pilzlichen Induktoren und Effektoren, welche diesen Wurzelzelltod initiieren und regulieren sind unbekannt. Um den vom Pilz verursachten Wurzelzelltodmechanismus besser zu charakterisieren, wurde die Auflösung der Nuklei in kolonisierten Arabidopsiswurzeln mittels verschiedener Färbungen unter dem konfokalen Laserrastermikroskop analysiert. Außerdem wurde eine pilzliche, sekretierte Endonuklease, genannt SiNUCA, im apoplastischen Fluid kolonisierter Gerstenwurzeln gefunden. SiNUCA wurde funktionell charakterisiert und es wurde überprüft, ob das Protein in der Zelltodreaktion involviert ist. SiNUCA ist ein konserviertes, kleines sekretiertes Protein, welches zur Superfamilie der His-Me Finger Endonukleasen gehört. Das Protein wurde über heterologe Expression in Ustilago maydis und über Proteinaufreinigung aus dem Kulturfiltrat von S. indica charakterisiert und es wurde gezeigt, dass SiNUCA zuckerunspezifische Nukleaseaktivität hat. Ektopische Expression in Arabidopsis führte zu einem erhöhten Kolonisierungslevel von S. indica und mehr Wurzelzelltod. SiNUCA lokalisierte in späten Kolonisierungsphasen im Pflanzennukleus, wo das Protein Zelltod ausführen könnte. Im Apoplast könnte SiNUCA an der Inaktivierung der extrazellulären DNA, welche ein sogenanntes «damage- associated molecular pattern» ist, beteiligt sein. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Widmer, Heidi UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-92652
Date:	22 October 2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	CEPLAS - Cluster of Excellence on Plant Sciences
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Agriculture
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language endonuclease; effector; Serendipita indica; Sebacinales; root endophyte; symbiosis; cell death; apoplast; nucleus; DAMP English Endonuklease; Effektor; Serendipita indica; Sebacinales; Wurzelendophyt; Symbiose; Zelltod; Apoplast; Nukleus; DAMP German UNSPECIFIED English
Date of oral exam:	22 October 2018
Referee:	Name Academic Title Zuccaro, Alga Prof. Dr. Kopriva, Stanislav Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9265