Universität zu Köln

Bruehl, Natalie (2015). Charakterisierung des Fructoseexports in Corynebacterium glutamiucm. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Inaugural-Dissertation_Natalie_Bruehl_FARBIG-1.pdf Download (7MB)

Abstract

Corynebacterium glutamicum ist einer der bedeutendsten Mikroorganismen der industriellen Biotechnologie. Bei der biotechnologischen Herstellung von Aminosäuren durch C. glutamicum stellt Saccharose die meist genutzte Kohlenstoffquelle dar. Als Alternative zu reiner Saccharose wird auch Melasse, ein Nebenprodukt der Zuckerherstellung, bei der Produktion von L-Lysin und L-Glutamat durch C. glutamicum kosteneffektiv genutzt. Da C. glutamicum keine Fructokinaseaktivität besitzt, setzt die vollständige Nutzung von Saccharose als Kohlenstoffquelle, den Export und Reimport des entstehenden unphosphorylierten Fructosemoleküls voraus. Der Reimport von Fructose über ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Phosphotransferase System (PTS) geht mit der für die Nutzung des Fructosemoleküls als Kohlenstoffquelle erforderlichen Phosphorylierung einher. Das Vorhandensein eines Exporters für Fructose wurde aufgrund der bisherigen Datenlage zwar angenommen, jedoch auf biochemischer Ebene bisher nicht untersucht und bestätigt. Der Fructoseexporter stellt sowohl ein interessantes Target zur Optimierung von Produktionsstämmen in Richtung der Saccharoseverwertung dar, als auch bei der Entwicklung von genomreduzierten Produktionsstämmen, die als Ziel die Herstellung eines Chassis-Organismus haben, der auf die wichtigsten metabolischen Eigenschaften beschränkt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Modellstamm C. glutamicum FIMS konstruiert, der die Charakterisierung des Fructoseexports ermöglichte. Der Modellstamm wurde auf Basis von Untersuchungen zur Fructoseaufnahme und zur intrazellulären Umwandlung von Fructose in andere Metabolite konstruiert. Dieser Stamm ist defizient in der Wiederaufnahme von Fructose und der Reduktion von Fructose zu Mannitol, welche den intrazellulären Verlust von Fructose herbeiführen würde. Zur biochemischen Charakterisierung des Fructoseexports wurde eine radiochemische Methode entwickelt, die eine Messung des Exports von Fructose spezifisch ermöglicht. Auf Basis dieser Methode wurde der Export von Fructose mithilfe des Modellstamms charakterisiert. Fructose wird sowohl spezifisch über mindestens zwei Transportproteine, als auch unspezifisch über mechanosensitive Kanäle exportiert. Der spezifische Efflux von Fructose erfolgt höchstwahrscheinlich über facilitated diffusion und mit einer Geschwindigkeitskonstanten k von 0,109 ± 0,025 min-1. Als Hauptexportsystem von Fructose wurde der MFS-Transporter Cg0772 identifiziert, welcher mit 60-80% am spezifischen Export beteiligt ist. Darüber hinaus ist mindestens ein weiteres, bisher nicht identifiziertes Transportsystem am spezifischen Efflux beteiligt. Anhand der erlangten Daten zum Fructoseexport wurde ein kinetisches Modell erstellt, welches die Modellierung des Fructoseefflux ermöglichte und somit zur Unterstützung der Datenanalyse herangezogen wurde. Damit trug das Modell signifikant zum Verständnis des Fructoseefflux bei.