Universität zu Köln

Strathmann, Eike (2022). Epigenetic regulation of PLS3 by the macrosatellite DXZ4 and the transcriptional regulator CHD4. PhD thesis, Universität zu Köln.

PDF (Doctoral Thesis Eike Strathmann) 1_PHD Eike Strathmann_Version60-final (ohne CV).pdf Download (8MB)

Abstract

Part I: Spinal muscular atrophy (SMA) is a devastating motor neuron disorder caused by homozygous loss of the Survival of Motor Neuron 1 (SMN1) gene and insufficient functional SMN protein produced by the SMN2 copy gene. Overexpression of Plastin 3 (PLS3) fully protects from mild types of SMA. The mechanisms that regulate PLS3 expression are not fully understood. We performed a multi-omics analysis of SMA-discordant families using lymphoblastoids, fibroblasts and iPSC-derived spinal motor neurons and identified mechanisms, which contribute to the regulation of PLS3. We found a 1-fold expression difference in spinal motor neurons of PLS3 between female asymptomatic and their SMA-affected brothers, which can be explained by the gene’s escape from X-chromosomal inactivation. The X-linked PLS3 is located in close proximity to DXZ4, a microsatellite, which is essential for X-chromosomal inactivation. By Molecular Combing, we measured the copy number of DXZ4 and found a significant correlation with the expression of PLS3 in females. Additionally, we identified Chromodomain Helicase DNA Binding Protein 4 (CHD4) as an epigenetic transcriptional regulator of PLS3. By application of siRNA-mediated knock-down, overexpression, chromatin immunoprecipitation and promoter luciferase assays, we validated the regulation of PLS3 by CHD4. Thus, we provide evidence for a multilevel epigenetic regulation of PLS3. Part II: Spinraza, a SMN antisense oligonucleotide (ASO) that restores full-length SMN2 transcripts, has been FDA- and EMA-approved for SMA therapy. Hence, the availability of biomarkers allowing reliable disease monitoring would be of great importance. The BforSMA study identified about 200 putative SMA biomarkers. We took advantage of a previously developed intermediate SMA mouse model, treated with presymptomatic low-dose SMN-ASO injections and measured the plasma concentrations of SMN and six other SMA biomarkers from the BforSMA study, namely Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP), Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP4), Tetranectin (C-type Lectin Family 3 Member B, CLEC3B), Osteopontin (Secreted Phosphoprotein 1, SPP1), Vitronectin (VTN) and Fetuin A (Alpha 2-HS Glycoprotein, AHSG). Only COMP and DPP4 showed high and SPP1 moderate correlation with the SMA phenotype. PLS3 overexpression from a human transgene neither influenced the SMN level nor the six biomarkers, supporting the hypothesis that PLS3 acts as an independent protective modifier of SMA.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Erster Teil: Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine schwere neurodegenerative Erbkrankheit, die durch homozygote Deletion des Gens Survival of Motor Neuron 1 (SMN1) ausgelöst wird. SMN1-deletierte Individuen besitzen ein oder mehrere Kopien des Gens SMN2, von welchem ungenügende Mengen des SMN Proteins transkribiert werden. Plastin 3 (PLS3) ist ein protektiver genetischer Modifikator von SMA. Die Mechanismen, die die Expression von PLS3 steuern sind weitgehend ungeklärt. In dieser Studie wurden Fibroblasten, Lymphoblasten und spinale Motorneuronen untersucht und Mechanismen entschlüsselt, die die Expression von PLS3 steuern. In spinalen Motorneuronen wurde eine Verdopplung der Genexpression von PLS3 in weiblichen asymptomatischen Individuen im Vergleich mit ihren männlichen Geschwistern festgestellt, die sich mit dem Entkommen des Gens aus der X-chromosomalen Inaktivierung erklären lässt. Der PLS3 Genlokus befindet sich auf dem X-Chromosom nur etwa 500 kb von dem Makrosateliten DXZ4 entfernt. Dieser zeichnet sich durch eine variable Kopienzahl aus und ist essentiell für die X-chromosomale Inaktivierung. Mittels Molekularem Combing ermittelten wir die genaue Kopienzahl von DXZ4 und fanden einen linearen Zusammenhang mit der Expression von PLS3 in Lymphoblastoiden. Darüber hinaus konnten wir das Protein Chromodomain Helicase DNA binding protein 4 (CHD4) als epigenetischen Regulator von PLS3 identifizieren. Mittels siRNA-induziertem Gen Knock-Down, Überexpressionsstudien, Chromatinimmunopräzipitation und Promoter-Luziferase Assays konnte dieser Zusammenhang validiert werden. Unsere Ergebnisse könnten hilfreich sein, um die Expression von PLS3 auch im Zusammenhang mit weiteren Erkrankungen zu verstehen. Zweiter Teil: Spinraza ist ein SMN antisense Oligonukleotid, welches in der Therapie von SMA eingesetzt wird. Die Möglichkeit den Fortschritt der Behandlung mittels Biomarkern zu verfolgen ist ein wichtiges Anliegen. Die BforSMA-Studie identifizierte mehr als 200 Biomarker, die mit SMA assoziiert sind. Wir haben die Konzentration von SMN und sechs weiteren Biomarkern (Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP), Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP4), Tetranectin (C-type Lectin Family 3 Member B, CLEC3B), Osteopontin (Secreted Phosphoprotein 1, SPP1), Vitronectin (VTN) und Fetuin A (Alpha 2-HS Glycoprotein, AHSG)) in einem intermediären SMA-Mausmodel untersucht. Dieses Mausmodell wurde präsymptomatisch mit geringdosierten SMN-Antisenseoligonukleotiden behandelt. Außerdem wurde die Auswirkung von PLS3- Überexpression mittels eines humanen Transgens auf die Plasma Biomarker untersucht. Lediglich COMP, DPP4 und SPP1 zeigten eine Korrelation mit dem SMA Phänotyp. Die Überexpression von PLS3 zeigte keine Auswirkung auf SMN und die übrigen sechs Biomarker. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Strathmann, Eike eike.strathmann1@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-643514
Date:	20 August 2022
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Spinal Muscular Atrophy UNSPECIFIED PLS3 UNSPECIFIED DXZ4 UNSPECIFIED
Date of oral exam:	14 November 2022
Referee:	Name Academic Title Wirth, Brunhilde Prof. Dr. Gehring, Niels Prof. Dr. Baumann, Ulrich Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/64351