Universität zu Köln

Nisar, Hasan (2023). Hypoxia-Induced Radioresistance in Human Non-Small Cell Lung Carcinoma Cell Lines. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Lung cancer accounts for 25 % of cancer-related deaths. Non-small cell lung carcinoma (NSCLC) constitutes 85 % of all lung cancers. Radiotherapy is used in treatment of over half of lung cancer patients. Tumor hypoxia is associated with treatment resistance particularly in the context of radiotherapy. Targeting tumor hypoxia to increase radiotherapy efficacy has met limited success clinically with no measurable mortality benefit. High linear energy transfer (LET) carbon ions are being used increasingly in cancer clinical trials and have the theoretical advantage of being less sensitive to the influence of oxygen. Studying DNA damage response (DDR) to low- (X-rays) and high-LET ionizing radiation under hypoxia may help identify molecular processes that can be potentially targeted therapeutically to overcome hypoxia-induced radioresistance. Additionally, tumor cells often experience reversible hypoxia due to tumor shrinkage secondary to treatment, neo-angiogenesis as well as intermittent vasospasm of feeding vessels. Thus, impact of reoxygenation on radioresistance also warrants greater understanding. The Nuclear Factor Kappa B (NF-kB) pathway is associated with cellular inflammatory response to stressors like ionizing radiation and hypoxia and has been associated with enhanced cell survival. However, the role of NF-kB pathway in hypoxia-induced radioresistance remains elusive. Therefore, the radioresistance of NSCLC cells was evaluated under continuous hypoxia and following reoxygenation by performing clonogenic assays following irradiation with the objective of correlating hypoxia induced radioresistance in NSCLC cells to DDR in terms of DNA double strand break (DSB) induction, DSB repair, cell cycle progression as well as activation of pro-survival NF-kB pathway. A549 (p53-wt) and H358 (p53-null) NSCLC cell lines were incubated after seeding for 48 h under hypoxia (0.1 % and 1 % O2) and normoxia (20 % O2) and irradiated using X-rays (200 KeV) and carbon ions (on target energy 25.7 MeV/nucleon). Following irradiation, hypoxic cells were either allowed to reoxygenate (transient hypoxia) or kept hypoxic (continuous hypoxia) till end of experiments. Radioresistance was evaluated in normoxic, continuously hypoxic and transiently hypoxic cells using Puck’s colony forming ability (CFA) assay. DDR four hours following irradiation was assessed at transcriptional level in terms of cell cycle modulation, DNA DSB repair and activation of pro-survival NF-kB pathway by carrying out RNA sequencing and differential expression analysis of relevant genes in continuously and transiently hypoxic cells in comparison to normoxic controls. Cell cycle progression was determined by flow cytometry of cells after staining their nuclei with 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI). DSB induction and repair was assessed using gamma H2AX immunofluorescence microscopy and NF-kB pathway activation was evaluated by p65 (NF-kB subunit) nuclear translocation using p65 immunofluorescence microscopy, and by measuring production of NF-kB target proteins, interleukin (IL) 6 and IL-8. CFA assays revealed that hypoxic cells were more radioresistant compared to normoxic controls when they were given 24 h to repair (late plating) following both X-rays and carbon ions exposure. Radioresistance was higher at 0.1 % O2 compared 1 % O2. Continuously hypoxic cells were more radiosensitive compared to normoxic controls when they were immediately re-seeded for growth of colonies following irradiation (immediate plating). This radiosensitivity was reversed if hypoxic cells were reoxygenated following irradiation (transient hypoxia). Carbon ions had a greater relative biological effectiveness (RBE) in killing hypoxic cells compared to X-rays. Cell cycle progression under hypoxia following both X-rays and carbon ions exposure in A549 and H358 cell lines was slowed as indicated by a greater proportion of cells in G1 phase and smaller population of cells in G2 phase compared to normoxic controls. Phase redistribution was similar at 0.1 % and 1 % O2. Differential expression analysis of cell cycle genes revealed weak transcriptional regulation in both cell lines indicating importance of post-translational cell cycle regulation in response to irradiation under hypoxia. Reoxygenation did not affect cell cycle phase distribution in first 24 h. DSB induction assessment based on H2AX foci count 1 h after irradiation was lower under continuous and transient hypoxia in case of X-rays exposure but not in case of carbon ions exposure. No residual DSBs were observed at a dose of 2 Gy X-rays but DSBs induced by carbon ions took longer to resolve compared to those caused by X-rays. Differential expression analysis of DSB repair genes was unremarkable but that for NF-B target genes showed overexpression of several pro-survival and pro-proliferation genes under hypoxia. The gene expression signature of both cell lines was unique with minimal overlap. Gene expression signature also varied following X-rays and carbon ions exposure. In case of H358 cells, reoxygenation resulted in transcriptional regulation of several genes not regulated under continuous hypoxia. IL-6 (following carbon ions exposure) and IL-8 (following both X-rays and carbon ions exposure) were upregulated in A549 cells while in H358 cells, only IL-8 was upregulated upon reoxygenation. Nuclear translocation of cytosolic p65 was found to occur earlier (at 2 h vs. 6 h) in A549 and H358 cells under continuous hypoxia (1 % O2) following both X-rays and carbon ion exposure compared to normoxia. Reoxygenation had a minimal effect on p65 nuclear translocation in A549 cells. In H358 cells, p65 nuclear localization increased in response to reoxygenation but was not affected by irradiation. Both IL-6 and IL-8 secretion by A549 cells was amplified under hypoxia regardless of reoxygenation and irradiation resulted in its further increase. IL-8 secretion by H358 cells was increased under both continuous and transient hypoxia but irradiation further increased its production only under continuous hypoxia. Hypoxia-induced radioresistance in continuously and transiently hypoxic A549 cells following X-rays and carbon ion exposure was found to be associated with cell cycle phase redistribution toward the radioresistant G1 phase, lesser DSB induction, earlier NF-B activation, greater NF-kB target gene expression and higher NF-B target protein synthesis and secretion. The same was true in case of continuously hypoxic H358 cells following X-rays exposure. However, transiently hypoxic H358 cells behaved differently: reoxygenation increased basal p65 nuclear translocation and IL-8 secretion but irradiation did not lead to further increase in p65 nuclear intensity and IL-8 secretion. Hypoxia-induced radioresistance effects faster growing cells (A549) more than less rapidly dividing cells (H358). Reoxygenation does not alter effects of hypoxia on cell survival, DNA damage and cell cycle but it does affect both cell lines differently in terms of NF-kB pathway activation and transcription of its target genes. While this work does not establish a causal relationship between NF-kB activation and radioresistance seen in hypoxic NSCLC cells, the association does show promise for further investigation into NF-kB as a potential molecular target for therapy in NSCLC. Although NF-kB activation is seen following high LET radiation exposure as well, hypoxic cells are more radiosensitive to carbon ions compared to low LET X-rays. Moreover, IL-6 and IL-8 secretion may serve as potential prognostic indicators of radioresistance.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Lungenkrebs macht 25 % der krebsbedingten Todesfälle aus. Bei 85 % aller Lungenkrebserkrankungen handelt es sich um das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC). Zur Behandlung von mehr als der Hälfte der Patienten mit Lungenkrebs wird Strahlentherapie eingesetzt. Tumorhypoxie ist insbesondere im Rahmen einer Strahlentherapie mit Therapieresistenz assoziiert. Die Ausrichtung der Strahlentherapie auf Tumorhypoxie zur Steigerung ihrer Wirksamkeit hatte bisher klinisch nur begrenzten Erfolg ohne messbare Reduktion der Mortalität. Kohlenstoffionen mit hohem linearem Energietransfer (LET) werden zunehmend in klinischen Studien zur Krebstherapie verwendet und haben den theoretischen Vorteil, dass ihre Wirkung weniger empfindlich gegenüber dem Einfluss von Sauerstoff ist. Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort (DNA damage response, DDR) in Reaktion auf ionisierende Strahlung mit niedrigem (Röntgenstrahlung) und hohem LET-Wert unter Hypoxie kann dazu beitragen, molekulare Prozesse zu identifizieren, in die möglicherweise gezielt therapeut eingegriffen werden kann, um die durch Hypoxie induzierte Strahlenresistenz zu überwinden. Zusätzlich erfahren Tumorzellen häufig eine reversible Hypoxie aufgrund einer Tumorschrumpfung infolge der Behandlung, von Neo-Angiogenese sowie von intermittierendem Vasospasmus der versorgenden Gefäße. Daher muss auch der Einfluss der Reoxygenierung auf die Strahlenresistenz besser verstanden werden. Der Nuclear Factor Kappa B (NF-kB)-Signalweg ist mit einer zellulären Entzündungsreaktion auf Stressoren wie ionisierende Strahlung und Hypoxie verbunden und wurde mit einem verbesserten Zellüberleben in Verbindung gebracht. Die Rolle des NF-kB-Signalwegs bei der Hypoxie-induzierten Strahlenresistenz bleibt jedoch schwer fassbar. Daher wurde die Strahlenresistenz von NSCLC-Zellen unter kontinuierlicher Hypoxie und nach Reoxygenierung bewertet, indem klonogene Assays nach der Bestrahlung durchgeführt wurden, mit dem Ziel, die durch Hypoxie induzierte Strahlenresistenz in NSCLC-Zellen mit DDR zu korrelieren in Bezug auf DNA Doppelstrangbruch (DSB)-Induktion, DSB-Reparatur und Zellzyklus-Progression sowie Aktivierung des überlebensfördernden NF-kB-Signalwegs. A549 (p53-wt) und H358 (p53-null) NSCLC-Zelllinien wurden nach der Aussaat für 48 h unter Hypoxie (0,1 % und 1 % O2) und Normoxie (20 % O2) inkubiert und mit Röntgenstrahlen (200 KeV) bestrahlt. und Kohlenstoffionen (Energie 25,7 MeV/Nukleon). Nach der Bestrahlung wurden hypoxische Zellen entweder reoxigeniert (vorübergehende Hypoxie) oder bis zum Ende der Experimente hypoxisch gehalten (kontinuierliche Hypoxie). Die Strahlenresistenz wurde in normoxischen, kontinuierlich hypoxischen und vorübergehend hypoxischen Zellen mit dem Puck-Assay der Koloniebildungsfähigkeit (colony forming ability, CFA) bewertet. Die DDR vier Stunden nach der Bestrahlung wurde auf Transkriptionsebene in Bezug auf Zellzyklusmodulation, DNA-DSB-Reparatur und Aktivierung des überlebensfördernden NF-B-Signalwegs bewertet, indem RNA-Sequenzierung und differenzielle Expressionsanalyse relevanter Gene in kontinuierlich und vorübergehend hypoxischen Zellen im Vergleich mit normoxischen Kontrollen durchgeführt wurden. Die Zellzyklusprogression wurde durch Durchflusszytometrie von Zellen bestimmt, nachdem ihre Zellkerne mit 4’,6’-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) gefärbt worden waren. DSB-Induktion und -Reparatur wurden mittels Gamma-H2AX-Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet. Die Aktivierung des NF-kB-Signalwegs wurde durch Translokation von der NF-kB-Untereinheit p65 in den Zellkern mit Hilfe von p65-Immunfluoreszenzmikroskopie und durch Messung der Produktion von NF-kB-Zielproteinen, Interleukin (IL) 6 und IL-8, erfasst. Die CFA-Assays zeigten, dass hypoxische Zellen im Vergleich zu normoxischen Kontrollen strahlenresistenter waren, wenn sie 24 Stunden Reparaturzeit hatten (spätes Ausplattieren), nachdem sie Röntgenstrahlen bzw. Kohlenstoffionen ausgesetzt waren. Die Strahlenresistenz war bei 0,1 % O2 höher als bei 1 % O2. Kontinuierlich hypoxische Zellen waren im Vergleich zu normoxischen Kontrollen strahlenempfindlicher, wenn sie unmittelbar nach der Bestrahlung erneut für das Wachstum von Kolonien ausgesät wurden (sofortiges Ausplattieren). Diese Strahlenempfindlichkeit kehrte sich um, wenn hypoxische Zellen nach der Bestrahlung wieder mit Sauerstoff versorgt wurden (vorübergehende Hypoxie). Kohlenstoffionen hatten im Vergleich zu Röntgenstrahlen eine größere relative biologische Wirksamkeit (RBE) beim Abtöten hypoxischer Zellen. Die Zellzyklusprogression unter Hypoxie nach sowohl Röntgen- als auch Kohlenstoffionen-Exposition in A549- und H358-Zelllinien wurde verlangsamt, wie sich durch einen größeren Anteil von Zellen in der G1-Phase und eine kleinere Population von Zellen in der G2-Phase im Vergleich zu normoxischen Kontrollen zeigte. Die Phasenumverteilung war bei 0,1 % und 1 % O2 ähnlich. Eine differentielle Expressionsanalyse von Zellzyklusgenen zeigte eine schwache Transkriptionsregulation in beiden Zelllinien, was auf die Bedeutung der posttranslationalen Zellzyklusregulation als Reaktion auf Bestrahlung unter Hypoxie hinweist. Die Reoxygenierung beeinflusste die Zellzyklusphasenverteilung in den ersten 24 h nicht. Die Bewertung der DSB-Induktion basierend auf der Anzahl der Gamma-H2AX-Herde 1 Stunde nach der Bestrahlung war unter kontinuierlicher und vorübergehender Hypoxie im Falle einer Röntgenstrahlen-Exposition niedriger, aber nicht im Falle einer Kohlenstoffionen-Exposition. Bei einer Dosis von 2 Gy Röntgenstrahlen wurden keine verbleibenden DSBs beobachtet, aber die Reparatur von durch Kohlenstoffionen induzierten DSBs dauerte länger als bei den durch Röntgenstrahlen verursachten. Die differenzielle Expressionsanalyse von DSB-Reparaturgenen war unauffällig, jedoch die der NF-kB-Zielgene zeigte eine Überexpression mehrerer überlebens- und proliferationsfördernder Gene unter Hypoxie. Die Genexpressionssignatur beider Zelllinien war einzigartig mit minimaler Überlappung. Die Signatur der Genexpression unterschied sich auch nach der Exposition gegenüber Röntgenstrahlen und Kohlenstoffionen. Im Falle von H358-Zellen führte die Reoxygenierung zu einer Regulation der Transkription mehrerer Gene, die unter kontinuierlicher Hypoxie nicht reguliert wurden. IL-6 (nach Kohlenstoffionen-Exposition) und IL-8 (sowohl nach Röntgen- als auch Kohlenstoffionen-Exposition) wurden in A549-Zellen hochreguliert, während in H358-Zellen nur IL-8 nach Reoxygenierung hochreguliert wurde. Es wurde festgestellt, dass die Kerntranslokation von zytosolischem p65 in A549- und H358-Zellen unter kontinuierlicher Hypoxie (1 % O2) sowohl nach Röntgenbestrahlung als auch Kohlenstoffionen-Exposition im Vergleich zu Normoxie früher auftrat (nach 2 h gegenüber 6 h). Die Reoxygenierung hatte eine minimale Auswirkung auf die Kerntranslokation von p65 in A549-Zellen. In H358-Zellen nahm die p65-Kernlokalisierung als Reaktion auf die Reoxygenierung zu, wurde aber durch die Bestrahlung nicht beeinflusst. Sowohl die IL-6- als auch die IL-8-Sekretion durch A549-Zellen wurde unter Hypoxie unabhängig von der Reoxygenierung verstärkt, und die Bestrahlung führte zu ihrer weiteren Zunahme. Die IL-8-Sekretion durch H358-Zellen war sowohl unter kontinuierlicher als auch vorübergehender Hypoxie erhöht, aber die Bestrahlung steigerte seine Produktion nur unter kontinuierlicher Hypoxie weiter. Es wurde festgestellt, dass die durch Hypoxie induzierte Strahlenresistenz in kontinuierlich und vorübergehend hypoxischen A549-Zellen nach Röntgenbestrahlung und nach Kohlenstoffionen-Exposition mit einer Umverteilung der Zellzyklusphase in Richtung der strahlenresistenten G1-Phase, einer geringeren DSB-Induktion, einer früheren NF-kB-Aktivierung und einer stärkeren Expression von NF-kB-Zielgenen inklusive ihrer Proteinsynthese und Sekretion assoziiert ist. Dasselbe galt für kontinuierlich hypoxische H358-Zellen nach Röntgenbestrahlung. Vorübergehend hypoxische H358-Zellen verhielten sich jedoch anders: Reoxygenierung erhöhte die basale p65-Kerntranslokation und IL-8-Sekretion, aber die Bestrahlung führte nicht zu einer weiteren Erhöhung der p65-Kernintensität und IL-8-Sekretion. Hypoxie-induzierte Strahlenresistenz beeinflusst schneller wachsende Zellen (A549) stärker als sich weniger schnell teilende Zellen (H358). Die Reoxygenierung verändert die Auswirkungen der Hypoxie auf das Zellüberleben, die DNA-Schädigung und den Zellzyklus nicht, beeinflusst jedoch beide Zelllinien unterschiedlich in Bezug auf die Aktivierung des NF-B-Signalwegs und die Transkription seiner Zielgene. Während diese Arbeit keinen kausalen Zusammenhang zwischen der NF-B-Aktivierung und der Strahlenresistenz in hypoxischen NSCLC-Zellen herstellt, ist die gefundene Assoziation vielversprechend für weitere Untersuchungen zu NF-kB als potenziellem molekularem Ziel für die Therapie von NSCLC. Obwohl die NF-kB-Aktivierung auch nach einer Exposition mit Hoch-LET-Strahlung zu beobachten ist, scheinen hypoxische Zellen im Vergleich zu Röntgenstrahlen mit niedrigem LET strahlenempfindlicher gegenüber Kohlenstoffionen zu sein. Außerdem könnten IL-6- und IL-8-Sekretion als potenzielle prognostische Indikatoren für Strahlenresistenz dienen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Nisar, Hasan hasanisar@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-654600
Date:	21 April 2023
Publisher:	Print Express 24
Place of Publication:	Cologne
Language:	English
Faculty:	Faculty of Medicine
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Hypoxia-induced radioresistance- X-rays and carbon ions exposure English NF-Kappa-B pathway activation and interleukins secretion following irradiation under hypoxia English effect of hypoxia on cell cycle English
Date of oral exam:	17 March 2023
Referee:	Name Academic Title Nisar, Hasan Prof. Dr. Pallasch, Christian Prof. Dr. Meder, Lydia Priv. Doz. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/65460