Universität zu Köln

Ruppert, Ann-Kathrin (2015). Integrative functional genomic search for regulatory DNA sequence polymorphisms influencing DNA methylation and mRNA expression in hippocampal brain tissue. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Neuropsychiatric disorders have a strong genetic predisposition, but their genetic basis remains elusive. Genome-wide association studies (GWASs) have mapped more than 2,000 susceptibility loci that were shown to increase the risk of common brain disorders. However, the majority of these susceptibility loci reside in non-coding regions and their functional consequences are unknown. The present study addresses the question whether regulatory sequence variants, affecting DNA methylation and gene expression, may be causal susceptibility alleles. I used an integrative functional genomics approach to investigate epigenetic regulation phenomena in human hippocampal brain of 115 European patients with pharmacoresistant mesial temporal lobe epilepsy. High-density SNP genotypes were correlated with genome-wide quantitative CpG methylation and mRNA expression levels using the Human Methylation450 array (HM450) and the Human HT-12 v3 array. Subsequently, a genome-wide map of methylation quantitative trait loci (meQTLs) and expression quantitative trait loci (eQTLs) was used to dissect regulatory SNPs (rSNPs) that confer susceptibility to common brain disorders at 488 known GWAS hits (P < 5.0 x 10-8). This is the first meQTL study of brain tissue applying the high-density HM450 array in specimens of fresh frozen human brain tissue obtained by epilepsy surgery at large scale. Linear regression analysis of this study implementing a correction for cell-type heterogeneity, identified 19,954 (8.5% of 362k CpGs) cis-acting meQTLs at a false-discovery rate (FDR) of 5%, which is a six-fold increase compared to previous meQTL studies that all investigated postmortem brain tissue. Specifically, cis-meQTLs were strongly enriched upstream of the gene promoter region (TSS201-1500; P = 7.7 x 10-61), highlighting the functional impact of this 5´-regulatory region that harbors binding sites of enhancers and insulators. Some of the most significant cis-meQTLs affected high-ranking candidate genes (ADARB2, HDAC4, NAPRT1, MAD1L1, PTPRN2 and RIMBP2) for neurodevelopmental disorders. To explore tissue specifity, the same approach was repeated in an additional meQTL analysis of whole blood cells originating from 496 German population controls without neuropsychiatric disorders. Results show that 65% of the meQTLs in brain tissues were also present in whole blood cells (Spearman’s Rank coefficient = 0.42). The present database of cis-meQTLs in brain and blood cells provides a key to select accessible epigenetic biomarkers for brain disorders in whole blood cells. The performed eQTL study identified 734 out of 31k mRNA probes at which expression levels were significantly influenced by cis-acting SNPs (FDR < 5%). Apart from meQTL and eQTL analyses, additionally a CpG methylation to gene expression correlation analysis was performed. This represents the first systematic delineation of methylation-driven genes in fresh frozen brain tissue. Both inverse correlations (73%) and positive correlations (27%) were observed, whereby the strongest inverse correlations were detected at NAPRT1, the gene encoding Nicotinate Phosphoribosyltransferase. Furthermore, the NAPRT1-associated meQTLs and eQTL were both genetically regulated by SNP rs9657360. The minor C allele of that very SNP was significantly associated with high methylation levels in the NAPRT1 promoter region and simultaneously associated with low gene expression of NAPRT1. Both, the tumor-specific hypermethylation of a promoter CpG island as well as loss of NAPRT1 expression have been previously proposed as predictive biomarkers for the therapy of carcinomas using NAMPT inhibitors. The additionally genetic risk constellation which has been identified by my approach – combining meQTLs and eQTLs to unravel the translational impact of epigenetic regulation of gene expression – is of high clinical relevance. It enables a diagnostically driven clinical strategy in tumorigenesis including the selection of patients which likely benefit from the administration of NAMPT inhibitors. To dissect imprinted meQTLs (imeQTLs) exhibiting differential methylation in a Parent-of-Origin (PofO) dependent manner, the CpG methylation states of blood cells in groups of 269 individuals stratified by parentally inverse heterozygous genotypes of nearby SNPs were compared. The imeQTL analysis revealed 177 CpGs at 31 genomic loci of which 22 were previously unknown. The strongest PofO effects were observed at loci harboring neurodevelopmental genes and on chromosome 3p21.1, which is a GWAS candidate region for mood disorders. Genes at genomic loci that show imprinting effects are promising candidate genes because of their potentially monoallelic gene expression which may unmask recessive susceptibility alleles. Enrichment analyses of genes associated with cis-meQTLs revealed an overrepresentation of genes implicated in GWAS hits of brain disorders (P = 5.8 x 10-4). Potential rSNPs at the GWAS candidate loci 1q31.2 (RGS1 gene locus) and 3p21.1 (PRBM1 gene locus) were identified. The allelic alteration of transcription factor binding sites by potential rSNPs is likely to result in changes of gene transcription or splicing processes which could contribute to pathogenic pathways underlying neuropsychiatric disorders. As exemplified in this thesis, the created database of autosomal meQTLs, imeQTLs and eQTLs in brain tissue provides a valuable resource to dissect rSNPs at GWAS hits and to decipher their functional effects.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Obgleich bekannt ist, dass die Ausprägung zahlreicher neuropsychiatrischer Erkrankungen genetisch bedingt ist, sind die grundlegenden Mechanismen dieses Zusammenhangs noch weitestgehend unbekannt. Eine Methode, um Einblicke in die Genetik neuropsychiatrischer Erkrankungen zu erhalten, sind genomweite Assoziationsstudien (GWASs). Mit Hilfe dieser konnten bisher über 2.000 Loci für genetische Risikofaktoren von Hirnerkrankungen identifiziert werden. Die Mehrheit dieser Loci befindet sich in nicht-codierenden DNA-Bereichen, was ihre funktionelle Erforschung erschwert. Die vorliegende Arbeit geht der Fragestellung nach, inwieweit regulatorische Sequenzvarianten, welche DNA-Methylierung und Genexpression beeinflussen, zur genetischen Disposition von neuropsychiatrischen Erkrankungen beitragen. Meine Studie nutzt einen integrativen Ansatz der funktionellen Genomik, um epigenetische Regulationen im hippocampalen Hirngewebe bei Patienten mit pharmakoresistenter mesialer Temporallappenepilepsie zu untersuchen. Hierzu wurden SNP-Genotypen mit genomweiter CpG-Methylierung und mRNA Genexpression korreliert. Die daraus resultierenden »genomweiten Landkarten« von quantitativen Methylierungs Trait Loci (meQTLs) und quantitativen Expressions Trait Loci (eQTLs) wurden zur Lokalisation von regulatorischen SNPs (rSNPs) verwendet die in Zusammenhang mit einigen Hirnerkrankungen stehen (488 GWAS Katalog Einträge, P < 5,0 x 10-8). Die vorliegende Arbeit stellt die erste meQTL Studie dar, welche den leistungsfähigen Human Methylation450 array auf Basis von frisch-gefrorenem menschlichem Hirngewebe verwendet. Mit Hilfe einer linearen Regressionsanalyse und unter Berücksichtigung einer Korrektur für die Gewebeheterogenität, wurden insgesamt 19.954 (8,5% der 362.000 CpGs) cis-regulierte meQTLs identifiziert. Dies entspricht einer Versechsfachung der bisher bekannten meQTLs aus postmortalem Hirngewebe. Eine signifikante Anreicherung der meQTLs in der 5´-regulatorischen Region vor den Genpromotoren (TSS201-1500; P = 7,7 x 10-61) spiegelt den funktionellen Einfluss dieser Region wider, welche Enhancer als auch Insulatoren beherbergt. Es hat sich gezeigt, dass einige der hoch signifikanten cis-meQTLs bekannte Kandidaten Gene für neurologische Entwicklungsstörungen beeinflussen (ADARB2, HDAC4, NAPRT1, MAD1L1, PTPRN2 und RIMBP2). Die Gewebespezifität wurde anhand einer weiteren meQTL-Analyse, unter Beibehaltung gleicher experimenteller Bedingungen, in Blutzellen von 496 deutsch stämmigen Kontrollproben ohne neuropsychiatrische Erkrankungen untersucht. 65% der im Hirngewebe identifizierten meQTLs konnten auch in Blutzellen wiedergefunden werden (Spearman Rank Koeffizient = 0,42). Diese nennenswerte Übereinstimmung eröffnet die Möglichkeit, epigenetische Biomarker für komplexe Hirnerkrankungen in einfach zugänglichem Gewebe auszuwählen. Die zusätzlich zur meQTL Analyse durchgeführte eQTL Analyse konnte unter den 31.000 mRNA-Sonden insgesamt 734 signifikant cis-wirkende eQTLs identifizieren. In einer weiteren Analyse wurden CpG-Methylierung und Genexpression korreliert – diese stellt die erste systematische Untersuchung dieser Form in frisch-gefrorenem Hirngewebe dar. Hierbei wurden sowohl negative (73%) als auch positive (27%) Korrelationen beobachtet. Die stärksten negativen Korrelationen wurden bei dem Gen NAPRT1, welches die Nicotinat Phosphoribosyltransferase kodiert, beobachtet. Des Weiteren konnte bei den mit NAPRT1 assoziierten meQTLs und eQTLs eine genetische Beeinflussung durch ein und denselben SNP rs9657360 festgestellt werden. Die Korrelations-Ergebnisse kombiniert mit der genetischen Beeinflussung des SNPs zeigten auf, dass das minor C Allel eben dieses SNPs mit einer erhöhten Methylierung in der NAPRT1-Promoterregion und einer verminderten Genexpression assoziiert ist. Die Kombination aus einer tumorspezifischen Hypermethylierung einer in der Promoterregion gelegenen CpG island mit gleichzeitiger Verminderung der NAPRT1 Expression wurde ebenfalls in der Krebsforschung erkannt: NAPRT1 kann als prädiktiver Biomarker zur Therapie von Karzinomen mit NAMPT Inhibitoren eingesetzt werden. Durch den innovativen Ansatz, translationale Auswirkungen der epigenetischen Regulation der Genexpression in Kombination mit meQTLs und eQTLs zu testen, wurde zusätzliche eine genetische Determination erkannt. Diese ist von großer klinischer Bedeutung, da sie einen Ansatz zur Erfassung von Patienten erlaubt, die von der Gabe von NAMPT Inhibitoren profitieren können. Zusätzlich wurde eine Imprinting meQTL (imeQTL) Analyse durchgeführt, um das Potential der Kombination aus Imprinting und Methylierung zu untersuchen. Zur Erfassung der imeQTLs wurde der Methylierungsstatus von 269 Individuen (auf Basis von Blutzellen), stratifiziert nach den elterlich inversen heterozygoten Genotypen, verglichen. Insgesamt konnten 177 CpGs an 31 genomischen Loci identifiziert werden, von denen 22 bisher unbekannte Imprinting Regionen darstellen. Die stärkste Auswirkung von Parent-of-Origin-Effekte auf Methylierung wurde in Regionen beobachtet, die Gene für neurologische Entwicklungsstörungen beherbergen, sowie im chromosomalen Segment 3p21.1, welches eine GWAS Kandidaten Region für affektive Störungen ist. Positionelle Gene in Imprinting Regionen sind aussichtsreiche Kandidaten Gene aufgrund ihrer potentiell monoallelischen Genexpression. Hierdurch wird es möglich, potentiell rezessive Erkrankungsmutationen zu ermitteln. Die Enrichment Analysen von cis-meQTL assoziierten Genen ergab eine Überrepräsentation von Genen, die positionell im Bereich von GWAS Loci liegen (P = 5,8 x 10-4). Potentielle rSNPs wurden in der GWAS Kandidaten Region von 1q31.2 (RGS1) und von 3p21.1 (PRBM1) lokalisiert. Die allelische Veränderung von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen durch potentielle rSNPs führt zu quantitativen Änderungen der Gentranskription oder Spleißprozessen, welche wiederum zu pathogenen Verläufen von neuropsychiatrischen Erkrankungen beitragen. Die aus diesen Studien hervorgehende Datenbank von autosomalen meQTLs, imeQTLs und eQTLs in Hirngewebe stellt eine wertvolle Quelle dar, um rSNPs zu identifizieren und deren Beteiligung an Erkrankungsprozessen aufzuklären. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ruppert, Ann-Kathrin a.ruppert@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-66046
Date:	May 2015
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Epigenetics, CpG Methylation, Human Methylation450k array, mRNA Expression, meQTL, eQTL, Imprinting, GWAS, SNPs, mesial Temporal Lobe Epilepsy, Fresh Frozen Human Hippocampal Brain Tissue English
Date of oral exam:	15 June 2015
Referee:	Name Academic Title Nürnberg, Peter Prof. Dr. Schneider, Peter Prof. Dr. Kloppenburg, Peter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6604